搜索
WhatareRNAi?•RNAi现象早在1993年就有报道:将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花,可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能,称这种现象是“共抑制”。•直到1998年,Fire等的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA,使基因“沉默”了。研究人员将这一现象称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。研究者因此获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。WhatareRNAi?RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被赋予不同的名称:•在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression）•在真菌中被称为基因阻抑（qulling）•在动物体内被称为RNA干扰（RNAi）现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、病毒诱导基因沉默(VIGS)、农杆菌介导等方式。VirusInducedGeneSilencing(VIGS)•病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)•是指通过对已知植物病毒的改造，将目标基因片段整合入病毒载体中，然后侵染植物,诱发RNAi途径,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴定。VIGS原理dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(RibonucleaseⅢ,RNaseⅢ)家族的成员;siRNA:小干扰RNA;RISC:RNA诱导沉默复合体VIGS应用的载体利用植物病毒作为载体的优点:•病毒能吸附到完整的植物细胞并将它们的核酸导入到细胞中•感染的植物细胞产生大量的病毒，因此重组病毒载体可以高效表达转入的外源基因。•病毒感染可以蔓延整个植株•病毒感染快VIGS应用的载体RNA病毒(最早最多)→1995,首次基于烟草花叶病毒TMV载体构建(携带八氢番茄红素脱氢酶PDS侵染烟草，上位叶片褪绿白化)→1998,马铃薯X病毒PVX(沉默PDS诱发白化效应)→2001,烟草脆裂病毒TRV(因其具有病毒症状较轻、沉默效率高、持续时间长、能够侵染分生组织应用，目前应用最广泛VIGS载体)PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。VIGS应用的载体DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度低)→1998,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMV的VIGS体系成功建立(第一例DNA病毒载体)→2004,非洲木薯花叶病毒ACMV→2008,棉花皱叶病毒CLCrV→2010,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导接种高效沉默水稻內源基因PDS，第1例能够通过农杆菌介导接种水稻的VIGS载体)VIGS应用寄主•寄主范围有限，针对不同的寄主植物往往需要开发不同的病毒载体。•2002，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，进一步在小麦上应用）•→2006，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV•→2006，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV）•→2010，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效率）VIGS的应用•抗旱研究中相关基因的功能分析•2011，沉默小麦上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(γ-ECS)三个基因。•沉默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有明显的变化，其叶片的卷曲萎蔫程度较为突出，说明这三个基因在小麦抗干旱胁迫中具有重要功能。VIGS的应用•品质改良相关基因的功能分析•2012，利用VIGS技术发现高分子量谷蛋白亚基HMV-GS1Bx14和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。•这也是首次报道VIGS技术应用于小麦穗子和籽粒相关的基因功能，同时这个体系的建立将会对研究与籽粒品质和在小麦渐成的籽粒中有关基因的功能起到很大帮助作用。VIGS优点•在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下即可进行VIGS分析。•操作简便，能快速获取表型。•无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要•可用于突变致死的基因功能研究。•可用于功能冗余基因的功能研究。•可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究。VIGS缺陷•VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以致VIGS技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术自身最大的局限性。•如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术目前需要解决的问题。•沉默持续的时间问题。•病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是VIGS技术实验操作中的关键性步骤。病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得•1.设计引物(保守序列，200bp)•2.构建载体(γ)•3.体外转录•(准备质粒，线性化质粒)•4.体外涂抹•5.观察病毒表型(BSMV)•（提取RNA,反转录成cDNA,检测基因表达水平）•6.观察表型