11基因治疗

第十一章基因治疗GeneTherapy本章，我们讨论4个问题。1.概述2.基因治疗的原理3.基因治疗中外源基因导入技术4.基因治疗的应用研究第一节概述人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变（如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。机体对外来侵袭抵御体现在以下4个层次：1.整体水平，诸如动物的打斗撕咬；2.细胞水平，如Mφ对“异已”吞噬作用；3.分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生106抗体分子，对付外来侵袭；4.基因水平，对付外源基因入侵，在原核生物中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。对于内源基因突变:至今未找到令人满意的治疗方法。基因治疗仅仅处于初始阶段。全世界接受基因治疗者106人，受试者600人定义：广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。一、基因治疗的概念基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一个新的治疗手段。二、基因治疗的策略两个基本策略:原位矫正病变基因基因取代或基因干预象外科移植手术，切除病变部分，换上正常健康基因，这在目前还难以做到(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)图11-1镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β珠蛋白基因点突变引起)(二)基因取代或基因干预基因置换(genereplacement)通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因基因增补(geneaugmentation)不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能基因干预(geneinterference)在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义RNA、核酶、三链DNA及干扰RNA技术三、基因治疗中的靶细胞生殖细胞:优点——治本困难——①生殖(学)生物学问题，极其复杂且不清楚。②伦理学问题名人精子库”，“美女卵子库”，总是别人的“种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必然，爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出租车（不是说开出租车不好，特此声明）体细胞——目前常用体细胞有：①淋巴细胞②骨髓细胞③内皮细胞④皮肤纤维细胞⑤肝细胞⑥肌细胞⑦角化细胞(keratinoyte)⑧多种肿瘤细胞附:选择靶细胞依据①疾病累及的主要部位。②靶细胞来源的难易程度。③体外培养的成活率和存活时间。④接受正常基因的能力。⑤新的正常基因能否在靶细胞能否正常表达和持续时间。四、基因治疗的途径1.间接体内疗法（exvivo）体外将治疗基因→靶细胞内,再将经基因修饰靶细胞→病人,使这种外源基因(细胞)在体内表达，从而达到基因治疗目的.(目前多采用这种疗法)。2.体内法(invivo)外源基因→直接导入体内有关组织器官→进入相应组织器官进行表达→从而达到基因治疗目的。基因治疗的基本原理第二节基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：治疗性基因的选择基因载体的选择病毒载体非病毒载体靶细胞的选择体细胞生殖细胞载体与治疗基因重组及筛选鉴定将重组DNA导入靶细胞,检测目的基因和标记基因的表达产物基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：基因转移间接体内疗法直接体内疗法转导细胞的筛选与鉴定回输体内利用标记基因和目的基因的表达产物利用核酸分子杂交考核疗效和安全性基因工程基因治疗1.目的基因应用或研究基因标志基因+治疗基因2.载体(原核或真核)(真核)3.靶细胞原、真核真核4.DNA体外重组√√5.重组DNA导入宿主细胞√√6.后处理√√基因治疗与基因工程的比较第三节基因转移技术生物学方法非生物学方法①逆转录病毒载体①磷酸钙共沉淀法②腺病毒载体②质粒DNA/脂质体法③腺相关病毒载体③电击法④单纯疱疹病毒载体④受体介导转移法⑤注射法以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）转移基因方法一.病毒载体——转基因的生物学方法（一）逆转录病毒的生活（命）周期逆转录病毒载体（二）逆转录病毒的基因组结构(三)逆转录病毒载体结构功能特点(四)重组逆转录病毒载体结构（五）重组逆转录病毒的制备（六）重组逆转录病毒基因转移系统（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸附在膜受体上。2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到hostDNA中去，转录、复制3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟病毒颗粒4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细胞，每个细胞可以释放105子病毒。（一）逆转录病毒的生活（命）周期图11-2Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图1.一般特征(1)正链RNA病毒即与mRNA极性相同（5‘→3’），反之为(一)；(2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾；(3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNA分子→细胞核并整合到宿主染色体,这种整合病毒DNA称为前病毒(provirus)(不管是源于RNA还是DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌)。（二）逆转录病毒的基因组结构图11-3逆转录病毒基因组的基本结构2．基因组结构(三)逆转录病毒载体结构功能特点保留病毒的LTR,ψ,去除病毒的结构基因,加上一个抗性标记基因LTRLTRψNeoAmproriE(四)重组逆转录病毒载体结构保留病毒的LTR,ψ,用目的基因和抗性标记基因置换了病毒的结构基因LTRLTRψNeoAmproriETargetgene常用逆转录病毒载体的结构示意图（五）重组逆转录病毒的制备是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装,不产生病毒颗粒。1．包装细胞(1)包装细胞定义①为了获得感染能力,逆转录病毒载体不含病毒的结构基因,不能产生gag、pol、env②野生型MO-MLV可供这些蛋白质，为什么不用野生型MO-MLV？包装后会产生大量有复制能力的野生型病毒颗粒，进入体内可能大量复制，具有插入突变危险，特别是插入激活癌基因，灭活抑癌基因危险，不利于治疗用。所以要设计一种细胞——重组逆转录病毒载体只能在其中包装成重组逆转录病毒颗粒（确切的说，只有一次感染能力），但能从中释放出来到靶细胞，这就是包装细胞，不产生复制能力的野生型包装结构。(2)为什么要包装细胞？(3)三代包装细胞第一代包装细胞ψ2细胞系:这种细胞的基因组中整合有仅仅缺失包装信号的MLV前病毒基因组。只要与载体（含）之间有一次重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒。第2代包装细胞PA317细胞系:含逆转录病毒PAM3基因组，缺失Ψ信号及部分5LTR，3LTR被SV40的多聚A化信号取代,与载体至少要经过2次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒第3代包装细胞ΨCRIP:含2种逆转录病毒基因组,每种不仅缺失Ψ信号,且仅含病毒的部分结构基因,经过多次独立重组，才能产生有复制能力的野生型病毒2．重组逆转录病毒的制备Ψ-LTRLTRψNeoLTRLTRψNeoTargetgeneLTRLTRgagpolenv形成假病毒,出芽释放到细胞外逆转录病毒载体重组逆转录病毒载体转染进包装细胞,整合后转录成RNA重组逆转录病毒的RNA被病毒蛋白包装包装细胞已整合有缺失ψ的逆转录病毒基因,可产生病毒的结构蛋白（六）重组逆转录病毒基因转移系统1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞靶细胞的最基本要求:细胞表面具有逆转录病毒相应的受体最常用作基因治疗的靶有：骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包括所有的肿瘤细胞2．基因转移的方法与途径exvivo分离培养宿主细胞,离体转移基因,效率高，但大多人体组织细胞原代培养比较困难。invivo重组逆转病毒载体直接注射的途径主要有：①采用静脉注射途径②直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中③直接将表达载体，3．重组逆转录病毒靶向基因转移①重组逆转录病毒前病毒整合位点的靶向性大多数前病毒的整合作用是随机的，对DNaseI超敏区域和转录活化区域的整合是具有优先整合的倾向性。在肿瘤中前病毒优先与细胞原癌基因和染色体脆性位点整合。②通过基因转移的方法与途径限制受感染细胞exvivo:被感染的靶细胞被预先选择，细胞靶向性能够很好地实现invivo:将重组病毒注射到特定的组织器官或其腔体内，以达到较好的组织细胞选择性基因转移的目的，如进行肿瘤实体内注射，使重组病毒主要感染肿瘤细胞。③病毒感染水平的限制利用逆转录病毒对人类细胞的某些亚群具有限制性的亲嗜性。如HIV和HTLV-1④基因转录水平的限制在逆转录病毒载体中导入具有基因表达调节作用的序列利用α-甲胎蛋白基因的肝组织特定性调节成分与TK基因相连5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTR插入外源cDNA5‘LTRψNeoAmproriE3‘LTRcDNAψSLTRSLTR转录gpemRNAψmRNA病毒蛋白质包装完成假病毒颗包装，分泌到包装细胞培养上清液中。逆转录感染靶细胞前病毒前病毒插入外源基因转录mRNA翻译蛋白质G418筛选逆转录病毒载体转染靶细胞的基本过程转染包装细胞，转录出RNA（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题1．产生野生型病毒存在有复制能力的野生型病毒，主要来源于载体ψ和不含ψ序列的辅助病毒重组成野生型病毒2．逆转录病毒载体插入的破坏性逆转录病毒载体携带的基因在受体细胞染色体上的基因组合是随机的。与临近基因相互作用,可能激活癌基因，灭活抑癌基因或破坏细胞生长的必需基因。3．污染问题由于病毒的感染性和寄生特性，使现在约85%基因治疗临床项目采用病毒载体。但是病毒载体存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特异性差，制备复杂及费用较高等不足。所以人们愈来愈重视非病毒法的研究。非病毒载体的本质是将基因治疗中基因看作为药物，然后从药剂和药理学的角度如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。基因作为药物发挥治疗作用的关键问题是导入的靶向性，表达的有效性和可调控性。二.非病毒载体转基因的非生物学方法非病毒载体优缺点优点缺点1.不需包装细胞，制备易、省时、滴度也不受限制，并且可对质粒或其他形式核酸进行快速分析；2.对基因大小或核酸类型不限；3.免疫原性低，急性毒性小，对受试者比较安全；4.可具有特异靶向性，并能转移至非分裂期细胞并有效表达；5.制备方便且重复性好，具有完全人工合成和大规模生产可行性，因此较简单和廉价。1.转移效率较病毒载体低。2.基因表达持续时间短；3.许多问题仍需求助病毒或病毒成分解决。1.方法用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质粒DNA转入细胞中。2.优点脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且在转移途中保护基因不被核酸酶降解。3.缺点转移效率低、制备麻烦、商品较贵。（一）脂质体介导的转移方法1．阳离子脂质体由带正电荷的脂类如四胺基去污剂、胆固醇阳离子衍生物、二酰基甘油和多胺的脂类衍生物和中性辅助脂类如二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）或二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）等摩尔混合组成。通过电荷的相互作用，阳性电荷的脂质体和带阴电荷的DNA之间可以有效地形成复合物。由于具有多余的正电荷，复合体可以与细胞膜带负电荷的唾液酸结合，然后通过内吞作用摄取载体复合体。2．阴离子（anionic）脂质体含有磷脂酰丝氨酸或含50%二棕榈磷脂酰甘油,由于磷脂和寡聚核苷酸均带负电荷，必须在脂质体中加入钙离子方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运的寡聚核苷酸首先定位细胞核，也延长了寡聚核苷酸在细胞内的保留时间。阴离子脂类可以置换阳离子脂质/DNA复合体的DNA3．pH敏感型脂质体可由二油酰胆碱（DOPE）、胆固醇和油酸以4：4：2（摩尔比）组成D