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一、DNA重组技术的基本工具1．DNA重组技术的“分子手术刀”(1)“分子手术刀”即。(2)来源：主要从中分离。(3)功能：识别、切割。(4)结果：产生或。限制性核酸内切酶原核生物特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端2．E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶(1)化学本质：。(2)功能上的相同点：均可催化形成。(3)功能不同点：可“缝合”黏性末端和平末端，则只能缝合“黏性末端”，不能缝合平末端。均为蛋白质磷酸二酯键T4DNA连接酶E·coliDNA连接酶3．基因工程常用的载体基因工程常用载体是，其化学本质是。二、基因工程的基本操作程序1．获取目的基因的手段①从中获取；②利用PCR技术扩增目的基因；③通过DNA合成仪用化学方法直接合成。质粒一种双链环状DNA分子基因文库2．基因工程的核心(1)是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。(2)基因表达载体的组成：除目的基因外，还必须有、和等。①启动子：是一段有特殊结构的，位于，是的部位。②标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有，从而。基因表达载体的构建DNA片段启动子终止子标记基因基因首端RNA聚合酶识别和结合目的基因将含目的基因的细胞筛选出来3．将目的基因导入受体细胞的方法(1)植物最常用：法，其次为法、法。(2)动物：最常用法，其受体细胞通常为。(3)细菌：法，需用处理细胞。农杆菌转化基因枪花粉管通道显微注射受精卵感受态细胞Ca2＋4．目的基因的检测和鉴定(1)首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。(2)其次还要检测。(3)最后检测。(4)有时还需进行。目的基因是否转录出了mRNA目的基因是否翻译出了蛋白质个体生物学水平的鉴定三、基因工程的应用与蛋白质工程1．基因工程的应用技术名称应用动物基因工程提高动物来提高产品产量；改善畜产品品质；用转基因动物生产；用转基因动物作器官移植的植物基因工程培育植物、抗病转基因植物和植物；利用转基因改良植物的品质生长速度药物供体抗虫转基因抗逆转基因技术名称应用基因治疗把导入病人体内，使其发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，分为体内基因治疗和基因治疗正常基因表达产物体外2．蛋白质工程(1)蛋白质工程的目标是：根据，对进行分子设计。(2)蛋白质工程的手段：对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过来完成。人们对蛋白质功能的特定蛋白质的结构基因需求考点一DNA重组技术的基本工具考情解读三种基本工具的作用涉及基因工程操作程序的关键步骤，近几年高考考查的频率较高，考查内容包括工具酶类型、实质及作用，运载体作用及特点等，预计2013年高考仍可能对各类型操作工具的作用及特点结合图形予以考查。[做一题][例1](2011·上海高考)回答下列有关基因工程的问题。(1)基因工程中使用的限制酶，其特点是____________。(2)下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别位点，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。①将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有________。(可多选)A．X1B．X2C．X3D．X4②若将上图所示X1、X2、X3、X4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养基上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有________、________。③如果X1用E1酶切，产生850对碱基和3550对碱基两种片段，那么质粒X2(Tcr基因的长度为1200对碱基)用E2酶切后的片段长度为________对碱基。④若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X4的细胞数与含X1的细胞数之比为1∶3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？________。原因是______________________________________。[解析](1)基因工程中使用的限制酶，其特点是特异性地识别和切割DNA。(2)①用限制酶E1切开质粒X1后，质粒X1暴露出两个黏性末端，Apr被切下。两端用E1切开的Tcr基因含有与上述切割后的质粒X1，Apr含有相同的黏性末端，混合后可形成X1、X2和X3。②含质粒X1的细胞可在含青霉素培养基上生长，含质粒X2的细胞可在含四环素培养基上生长；含质粒X3的细胞不含抗性基因，不能在两种培养基上生长；不含有质粒的细胞也不能在两种培养基上生长。③X2的长度为1200＋3550＝4750，用E2酶切后质粒由环状变为链状。④两段DNA黏性末端相同，DNA连接酶对DNA片段没有选择性，故增大DNA连接酶用量不能提高上述比例。[答案](1)特异性地识别和切割DNA(2)①ABC②无质粒细胞含X3的细胞③4750④不能DNA连接酶对DNA片段没有选择性/两段DNA末端相同[链一串]1．正确界定几种关键酶种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA分子两条链之间的氢键打开种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子2．限制酶两种作用结果比较DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端(如下图所示)。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。3．基因工程中“分子运输车”一载体的必备条件①对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动；②具标记基因，能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定；③能自我复制，通过复制进行基因扩增；④具有多个酶切位点，供外源基因插入其中，而且每种酶切位点最好只有一个，避免酶切后环状DNA打开，丢失某些片段。[关键一点](1)限制酶与DNA连接酶可存在如下关系：(2)限制酶不切割自身DNA，原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)DNA连接酶起作用时不需要模板，DNA聚合酶起作用时则需模板。(4)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。[通一类]1．关于DNA重组技术基本工具的说法正确的是()A．DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端B．细菌细胞中含有的限制酶不能对自身DNA进行剪切C．限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端D．天然的质粒就可以用来作为载体解析：DNA连接酶分为两类，一类是E·coliDNA连接酶，另一类是T4DNA连接酶，前者只能连接双链DNA片段互补的黏性末端；细菌细胞中含有的限制酶不能对自身DNA进行剪切；限制酶切割DNA后可能产生黏性末端，也可能产生平末端；天然的质粒要用来作为载体必须进行人工改造。答案：B2.(2012·杭州检测)右图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是________，二者还具有其他共同点，如①____________，②____________(写出两条即可)。(2)若质粒DNA分子的切割末端为—A—TGCGC，则与之连接的目的基因切割末端应为__________；可使用________把质粒和目的基因连接在一起。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为________，其作用是____________________________________。(4)下列常在基因工程中用作载体的是()A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因B．土壤农杆菌中的RNA分子C．大肠杆菌的质粒D．动物细胞的染色体答案：(1)DNA能够自我复制具有遗传效应(2)CGCGT—DNA连接酶(3)标记基因供重组DNA的鉴定和选择(4)CA—考点二基因工程的基本操作程序考情解读基因工程的基本操作程序是近几年高考的高频考点，分值比重较大，一般和其他工程结合考查，考查形式既有简答题又有选择题。预计2013年高考通过与其他工程技术综合考查学生解决实际问题的能力题目仍会出现。[做一题][例2](2011·海南高考)回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是____________________________________________。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为________________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成______，常用抗原—抗体杂交技术。(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。[解析]限制酶切割DNA可以产生黏性末端或平末端。一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，保证产生相同的黏性末端。基因表达载体中启动子是RNA聚合酶结合并识别的位置，驱动基因转录。用大肠杆菌作为受体细胞时，要用CaCl2溶液(或Ca2＋)处理，以利于表达载体进入。检测目的基因是否转录，可用DNA分子杂交技术检测，检测目的基因是否表达出蛋白质，可用抗原—抗体杂交技术检测。目的基因插入农杆菌Ti质粒的T—DNA中，然后插入植物细胞的染色体DNA上。[答案](1)平相同(2)提供RNA聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录(其他合理答案也可)CaCl2溶液(或Ca2＋)DNA—RNA分子杂交(或分子杂交技术)胰岛素原(蛋白质)(3)T—DNA染色体DNA[链一串]1．目的基因的获取(1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。(2)人工合成目的基因的常用方法：①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。②以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。(3)利用PCR技术扩增目的基因：①原理：DNA双链复制。②条件：模板、四种游离的脱氧核苷酸；热稳定的DNA聚合酶、引物等。③过程：加热至90～95℃，DNA解链→冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链→加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。2．基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。(2)组成如下图目的基因启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA终止子：位于基因的尾端，使转录停止标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因(3)构建步骤：3．将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞生物种类植物动物微生物转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合吸收DNA感受态细胞分子4．目的基因的检测和鉴定类型步骤检测内容方法结果分子检测第一