基因芯片的操作流程及步骤

1CELL=23PAIRSOFCHROMOSOMES23PAIRSOFCHROMOSOMES=~3,200,000,000BASES1HUMANBODY=100,000,000,000,000CELLS基因芯片结构示意图生物芯片的制作步骤细胞对mRNA进行标记杂交基因表达资料基因芯片研制的总体蓝图研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析简介•基因芯片•探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术•激光共聚焦显微技术大量探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于500）于固定支持物上检测每个探针分子的杂交信号强度与被标记的样品分子进行杂交获取样品分子的数量和序列信息一次性对样品大量序列进行检测和分析，解决了传统核酸印迹杂交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程序低、操作序列数量少、检测效率低等不足。基因芯片是信息时代的产物横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学等现代高科技。•中科院遗传所人类基因组中心•北京大学•联合基因集团有限公司我国第一家批量生产基因芯片拥有近2千条基因药物发明专利•东南大学吴健雄实验室•中科院计算所生物信息学实验室•上海生科院4.我国主要研究单位我国基因芯片的研究现状•目前，我国尚未有较成型的基因芯片问世，但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作，并取得了一些可喜的进展。标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。•涉及领域：生命科学、计算机科学、精密机械科学生物芯片分类•根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。6400点的基因芯片（面积12X14mm)基因芯片（genechip）的原理•基因芯片的测序原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶序列的核酸。基因芯片又称DNA微阵列（DNAmicroarray）•三种主要类型：•1）固定在聚合物基片（尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段——通过同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测•2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列——通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测•3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列——与荧光标记的靶基因杂交进行检测把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片原型主要类型•多种方法将寡核苷酸或短肽•固定到固相支持物上•原位合成（insitusynthesis）•合成点样•支持物：玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等薄膜型、玻片型微板型集成电路型基因芯片/DNA微阵列GeneChip/DNAMicroarray核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。第二节、基因芯片技术核酸体外杂交技术表达型基因芯片的设计一、基因芯片（DNA微阵列）寡核苷酸芯片、cDNA芯片、Genomic芯片模式一：是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析，模式二：将大量探针分子固定于支持物上，适合对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。1.基因芯片原理基因芯片是在基因探针的基础上研制出的。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片技术是建立在Southernblot基础之上的，可以说它是Southernblot的改进和发展，它的原理是：变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。2.基因芯片的基本原理分析•任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列：•这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。•亚序列中A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。•假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。•可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。原理--通过杂交检测信息一组寡核苷酸探针—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATCATACGTTA基因芯片荧光标记的样品共聚焦显微镜获取荧光图象杂交结果分析探针设计杂交提出问题芯片设计芯片制作●点样方法●在片合成试样处理芯片杂交杂交检测数据分析实际应用●PCR扩增●靶基因标记●表达差异分析●多态性分析●再测序●生物信息学●数学优化●数据库基因芯片的相关技术示意图二、基因芯片基本操作流程•制备总RNA→mRNA经RT--PCR用Cy3（正常对照组）和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得到cDNA探针→混合标记探针→与表达谱芯片上核苷酸片段（或基因）杂交→扫描→分析杂交结果→结论•载体+寡核苷酸-探针分子+荧光染料-点样仪-扫描仪-计算机+专业软件基因芯片流程样品制备芯片制备杂交杂交信号检测数据分析基因芯片的操作流程基因芯片流程（一）1.实验设计2.样品制备（指mRNA或总RNA样品，包括对照组和实验组。将mRNA或总RNA分别进行逆转录生成cDNA，然后将对照组和实验组cDNA分别标记Cy3和Cy5荧光信号）3.芯片制备（寡核苷酸探针或cDNA探针，包括PCR，纯化，点样等步骤）例基于芯片的基因测序基因芯片流程（二）4.芯片杂交（将用Cy3和Cy5荧光标记的对照组和实验组的cDNA等量混合，与芯片进行杂交）5.芯片扫描（采用激光扫描仪，分别用532nm和635nm波长激光扫描芯片，对于每张芯片，得到Cy3和Cy5通道两幅图象）cDNAspottedmicroarrays基因芯片流程（三）6..图象处理（采用专门软件，对图象进行分析，提取每个点上的数字信号，得到原始数据表）7.数据校正和筛选（对Cy5或Cy3信号进行校正，消除实验或扫描等各环节因素对数据的影响，同时利用筛选规则对数据中的“坏点”，“小点”，“低信号点”进行筛选，并作标记）基因芯片流程（四）8.目的基因或序列的确定（采用ratio值对差异基因进行判断，或采用统计方法如线性回归、主成分分析、调整P值算法等对差异基因进行统计推断）9.生物信息学分析（如cluster算法、差异基因的同源性比对，差异基因的相关文献检索等）微流控芯片检测仪基因芯片的阅读分析系统芯片扫描仪芯片杂交盒三、基因芯片设计步骤1.基因芯片设计的一般性原则基因芯片设计主要包括两个方面:1.探针的设计–指如何选择芯片上的探针2.探针在芯片上的布局–指如何将探针排布在芯片上。•确定芯片所要检测的目标对象–查询生物分子数据库取得相应的DNA序列数据–序列对比分析找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。–数据库搜索•得到关于序列突变的信息及其它信息。•在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面：(1)互补性(2)敏感性和特异性(3)容错性(4)可靠性(5)可控性(6)可读性基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析基因芯片的制作方式原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成法原位合成法•主要为光引导聚合技术（Light-directedsynthesis），不仅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。•主要步骤为：•首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。•每次选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。•每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点是可以用很少的步骤合成及其大量的探针阵列1、原位光蚀刻合成寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。2、光导原位合成法•是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。•这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为5－10μm，但只能制作II型DNA芯片。3、原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。4、点样法点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点