基因克隆与表达

蛋白原核表达卫文强2015.12目的基因-T表达载体酶切，胶回收，连接转化到克隆用细胞（Top10)提质粒，酶切验证转化到表达用细胞（BL21（DE3)）诱导表达SDS-PAGEDNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1）.DNA的纯度影响限制性内切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。3）.温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。是影响限制酶活性的重要因素。4）.缓冲液(Buffer)商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。•用时在冰上操作；•取酶用干燥、灭菌、新的枪头•酶用量不能超过酶切总体积的10%；•多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液；关心小贴士告诉你使用时注意事项：连接、转化与重组子鉴定1、连接（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+（2）.连接条件ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mMNaCl，提高连接效果；PEG：5%以下可以提高连接效率连接效果最好在37℃，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16℃，较好的连接效果，互补又较稳定;2）连接温度：3）反应液中的成分：目的或作用：4）插入片段与载体的浓度比例载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。化学法（CaCl2法)：转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。2、转化影响转化率的主要影响因素:载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；受体细胞的类型及预处理；转化方法：电击法高于化学法。ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori限制性酶切图谱法3、转化子的筛选和鉴定质粒DNA的提取基因组DNA质粒DNA质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。ⅰ质粒DNA提取方法：碱裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。ⅲ抽提出质粒的构型：1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。抽提出的质粒三种构型电泳结果：1）开环2）线状3）超螺旋+-电泳方向凝胶电泳技术电泳目的：对核酸分子进行分离和检测♦凝胶分辨DNA的能力：琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶浓度分辨范围(kb)浓度分辨范围(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-5000.7%0.8-108.060-4000.9%0.5-71240-2001.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100凝胶浓度:浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小原来如此！电泳缓冲液pH值：偏碱性，带负电荷离子浓度：离子浓度高电流大发热快胶溶解种类：TAE（Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集TBE（Tris+EDTA+硼酸）:缓冲能力最强TPE（Tris+EDTA+磷酸）:缓冲能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸钠）pET表达载体•pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。•T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。•T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。T7表达系统转录调控的机理化学诱导型噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。T7RNA聚合酶基因lac启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA聚合酶IPTG诱导BL21:lon,ompTBL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gamiOrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)菌株种类基本原理SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。基本步骤•制备分离胶•制备浓缩胶•上样并电泳•凝胶板剥离与染色脱色•结果分析加入分离胶溶液pH8.8封水出现明显界面时，分离胶凝聚完成（３０min~１h）倒出水，并用滤纸吸干制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH8.8加入样品上样及电泳开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。凝胶板剥离与染色•电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1-2小时左右。•脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质条带清晰。结果分析标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）相对迁移率以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。