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思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。引起星星活性的因素:甘油浓度高（5%），酶过量（100U/ml），离子强度低（25mmol/L），pH值过高（8.0），或是加了有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了Mg2+。4.T4DNAligase和E.coliligase有什么异同？5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是37℃，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16℃间，通常多选用12-16℃30分钟到16小时。6.什么是Klenow酶？有什么作用？KlenowDNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影响。也称为Klenow片段（Klenowfrgment），或E.coliDNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coliDNApolymeraseⅠlargefragment）。它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa。由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。①补平3′凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③通过置换反应对DNA进行末端标记④在cDNA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA···7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？···8.哪些工具酶可以用于探针标记？T4DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。第三章分子克隆载体1.基因工程载体应具备哪些特点？能在宿主细胞中独立复制；有一定的选择标记，易于识别和筛选；有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制;最好有较高的拷贝数，便于载体制备。2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？能独立复制的单链或双链DNA;选择标记基因；合适的限制酶位点。···3.请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？丝状噬菌体载体的优点a.可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针双链：为含双链RFDNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链DNA。具有质粒的优点b.丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA长7倍的DNA。缺点a.较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。b.单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子(尤其是双链分子)比较费力，同时由于重组DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。c.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNA片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。克服“缺失”的办法a.侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养b.应用贮存于-70℃，重组phageM13感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养c.培养时间应尽可能短(通常4-8h)d.收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养(因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子)。第四章人工染色体载体1.大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？·····2.简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。·····3.简述黏粒、YAC、BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件。4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？黏粒的优点（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性（2）具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点a.两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。b.含不同重组DNA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。第五章表达载体····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？2.简述利用T7噬菌体启动子的pET系列表达载体的工作原理。····3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？···5.分泌表达载体需要哪些基本元件？···6.什么是融合表达？有什么优点？第8章PCR技术及其应用···1.简述PCR扩增的原理和过程？PCR反应特点：特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低PCR的基本原理是什么？用PCR扩增时，必须预先得知什么信息？a.DNA的半保留复制原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。b.至少要知道足够合成一对引物的靶DNA序列。·过程:a.变性（denaturation）：将模板DNA置于92-96℃，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；b.退火（annealing）：将温度降至37-72℃，使引物与模板的互补区相结合；c.延伸（extension）：在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3‘-OH端，合成DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。PCR引物有哪些基本要求？在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1pmol/μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1kb的DNA片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。引物设计要考虑的几个问题①长度：至少16bp，通常为18-30bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。②解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5℃。③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基）④G＋C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3′末端的重复排列。⑤引物的3′末端最好是G或C，但不要GC连排。·PCR技术产生污染的主要原因和预防方法？污染原因：1、样本间交叉污染2、PCR试剂污染3、PCR扩增产物污染4、实验室中克隆质粒的污染预防方法：A.防止污染：试剂小量分装，吸头及EP管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作B、设立对照：阳性对照阴性对照包括：标本对照和试剂对照。···PCR技术有哪些应用？···2.T/A克隆的基本原理是什么？第九章DNA序列分析1.简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。a.原理：将待测DNA片段的5‘端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-by-lane）的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。b.核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5′或3′）打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。化学降解测序法的基本步骤包括：（1）对待测DNA片段的5′端磷酸基团作放射性标记；（2）用化学修饰剂修饰特定碱基；（3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度（4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标记端相同、起始位点相同，所以，根据断裂部位至标记端起始部位之间的距离（片段长度），即可得出碱基顺序。化学降解测序法的应用Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；a.对未经克隆的DNA片段可以直接测序。b.化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤、G＋C含量较高的DNA片段以及短链的寡核苷酸片段的序列。c.测定长度大约250个碱基2.简述Sanger双脱氧链终止法测序的原理。双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3’位置的-OH缺失，致使下位核苷酸的5’磷酸基团无法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。···3.试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选1.基因组DNA文库有哪些类型？其相关的特点是什么？⑴质粒文库质粒是最早用于构建基因组文库的载体，质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10kb以内。这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。⑵噬菌体文库噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l噬菌体载体、M13单链噬菌体载体、P1噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。M13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建cDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。噬菌体文库中应用最广泛的是l噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用l噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用。⑶黏粒文库黏粒又称柯斯质粒，是由l噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。利用它们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组DNA文库等。⑷人工染色体文库包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1人工染色体文库，也称为大片段基因组DNA文库，容纳的外源DNA片段为100kb-1Mb。主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越来越广泛。⑸亚基因组文库亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。···2.构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？3.均一化cDNA文库构建的基本原理是什么？mRNA-cDNA杂交方法的原理是用过量的驱动mRNA与供体的cDNA文库质粒反复多轮杂交，去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化的、扣除杂交cDNA文库。4.扣除cDNA的基本原理是什么？扣除杂交技术（subtractivehybridization）将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本（tester），将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本（driver）。将tester和driver的cDNA进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。···5.全长cDNA文库构建的原理？6.酵母双杂交的基本原理？酵母双杂交系统简称双杂交系统（two-hybridsystem），也叫相互作用陷阱（interactiontrap），是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是探针的直接编码物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与已知基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因。·酵母双杂交系统的基本原理来自酵母转录激活因子（transcriptionalactivator）GAL4是一种典型的转录因