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1第2节基因工程及其应用（第1课时）知识链接及考试地位本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。知识回顾1、DNA分子的结构特点是什么？2、什么是基因重组？学习目标1、简述基因工程的诞生。2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。重难点1．教学重点基因工程的基本原理。2．教学难点基因工程的基本原理新知探究传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。一、基因工程的原理基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。二、基因工程的原理、操作对象各是什么？三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？2六、基因工程的优点是什么？七、基因重组与基因工程比较比较项目基因重组基因工程不同点重组方式繁殖方式变异大小相同点拓展延申基因工程技术一、基因工程诞生的理论依据（1）DNA是遗传物质不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA上，但是这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生。DNA并不影响不同基因的重组或互换。A：肺炎双球菌转化实验1944年美国微生物学家Avery，通过细菌（肺炎链球菌）转化（有毒与无毒）研究确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。B：噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase用标记物的噬菌体（P32和S35）感染大肠杆菌，发现只有P32标记的DNA注入寄主细胞才能繁殖下一代进一步证明遗传物质是DNA。（2）DNA双螺旋结构1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。（3）中心法则和遗传密码遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨基酸。现在，基因是可以人工会成的。（4）基因是可切割的基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一3个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。（5）基因是可以转移的基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。由此表明基因不仅是可转移的。（6）多肽与基因之间存在对应关系现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。（7）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。二、基因工程的研究内容-----基础研究基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和cDNA文库，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。1、基因工程克隆载体的研究基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程研究首先得以迅速发展。Ti质粒的发现以及成功地构建了Ti质粒衍生的克隆载体后，植物基因工程研究随之就迅速发展起来。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体还须大力发展。2、基因工程受体系统的研究基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即原核生物和真核生物。原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，应用技术成熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主；以大肠杆菌为受体建立了一系列基因组文库和cDNA文库，以及大量转基因工程菌株，开发了一批已投入市场的基因工程产品。蓝细菌（蓝藻）是进行植物型光合作用的原核生物，兼具植物自养生长和原核生物遗传背景简单的特性，便于基因操作和利用光能进行无机培养。因此，近年来蓝细菌开始被用作廉价高效表达外源目的基因的受体系统。酵母菌是十分简单的单细胞真核生物，具有与原核生物很多相似的性状。酵母菌营异养生长，便于工业化发酵；基因组相对较小，有的株系还含有质粒，便于基因操作。因此酵母菌是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。酵母菌不仅是外源基因（尤其是真核基因）表达的受体，建立了一系列工程菌株，而且成为当前建立人和高等动物、植物复杂基因组文库的受体系统。真核生物单细胞小球藻和衣藻也被用于研究外源基因表达的受体系统。随着克隆载体的发展，至今高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目前用作基因工程受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单子叶植物水稻、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。动物鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞或胚细胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。动物体细胞也用作基因工程受体，获得了系列转基因细胞系，用作基础研究材料，或用来生产基因工程药物。随着克隆羊的问世，对动物体细胞作为基因4工程受体的研究越来越被重视，将成为21世纪初重要研究课题之一。人的体细胞同样可作为基因工程的受体，转基因细胞系用于病理研究。近年来还以异常生长的细胞作为受体，通过转基因使其回复正常生长状态（基因治疗）。3、目的基因研究基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。因此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有基因专利多，谁就在基因工程领域占主导地位。基因工程研究的基本任务是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。具有优良性状的基因理所当然是目的基因。而致病基因在特定情况下同样可作为目的基因，具有很大的开发价值。即使是那些今天尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。近年来也广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出需要的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。现在已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。近年来越来越重视基因组的研究工作，试图搞清楚某种生物基因组的全部基因，为全面开发各种基因奠定基础。据统计，至1998年完成基因组测序的生物有11种，如嗜血流感杆菌（1830137bp，1743个基因）、产甲烷球菌（1664976bp，1682个基因）、大肠杆菌K-12（4639221bp，4288个基因）、啤酒酵母（～12x10bp，5882个基因）、枯草杆菌（Bacillussubrilis）（4．21X10bp，4100个基因）。早在20世纪80年代就有人对人类基因组产生了兴趣，提出人类基因组研究计划。从1990年开始，先后由美国、英国、日本、德国、法国等国实施“人类基因组计划”，我国于1999年9月也获准参加这一国际性计划，在北京和上海分别成立了人类基因组研究中心，承担人类基因组1％的测序任务。这些国家聚集了一批科技人员，经过十年的辛勤工作，于2000年6月宣告人类基因组“工作框架图”已经绘制完毕。同时已破译了近万个基因。至1999年，美国对6500个人类基因提出了专利申请。一般认为人类基因组含有数万个基因，各司其职，控制着人的生长、发育、繁殖。一旦人类基因组全部被破译，就可了解人类几千种遗传性疾病的病因，为基因治疗提供可靠的依据，并且将保证人类的优生优育，提高人类的生活质量。除“人类基因组计划”以外，目前正在实施“水稻基因组计划”。以稻米为主食的我国早在1992年8月正式宣布实施“水稻基因组计划”，并且是目前国际“水稻基因组计划”的主要参加者，并于2001年10月12日，中国科学院、国家计委、科技部联合召开新闻发布会，宣布具有国际领先水平的中国水稻（税稻）基因组“工作框架图”和数据库在我国已经完成。这一成果标志着我国已成为继美国之后，世界上第二个能够独立完成大规模全基因组测序和组装分析能力的国家，表明我国在基因组学和生物信息学领域不仅掌握了世界一流的技术，而且具备了组织和实施大规模科研项目开发的能力。籼稻全基因组“工作框架图”的完成，将带动小麦、玉米等所有粮食作物的基础与应用研究。此外，中国、美国合作的“家猪基因组计划”也已经启动。4、基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。现已从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNA分子的需要。5耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热门课题。DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶，前者只能连接具勤性末端的DNA片段；后者既能连接具默性末端的DNA片段，也能连接具平末端的DNA片段。DNA聚合酶用于人工合成连杆、引物等DNA小片段以及含基因的较大的DNA片段，还用于制备DNA探针。多种耐热性DNA聚合酶的发现，使使PCR技术迅速发展．给当今生命科学提供了先进的研究手段。5、基因工程新技术研究围绕外源基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高了外源DNA转化的效率。围绕基因的检测方法，在放射性同位素标记探针的基础上，近年来又发展了非放射性标记DNA探针技术和荧光探针技术，如生物素标记DNA探针、Dig标记DNA探针、荧光素标记DNA探针等。PCR技术的发展不仅大大提高了基因检测的灵敏度，而且为分离基因提供了快速简便的途径。PCR技术自从1985年建立以来，发展很快，除一般采用的常规PCR技术外还发展了多种特殊的PCR技术，如长片段PCR技术、反转录PCR技术、免疫PCR技术、套式引物PCR技术、反向PCR技术、标记PCR技术、复合PCR技术、不对称PCR技术、定量PCR技术、锚定PCR技术、重组PCR技术、加端PCR技术等等。凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同