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水稻小粒密穗突变体sep１的遗传分析、基因定位与育种利用王跃星１,＃吴昆２,＃方云霞１陈红旗１倪深１付向东２朱旭东１,∗(１中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室,杭州３１０００６;２中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京１００１０１;＃共同第一作者;∗通讯联系人,EＧmail:ricezxd＠１２６．com)GeneticAnalysis,GeneMappingandBreedingApplicationofSmallGrainandDensePanicleMutantsep１inRiceWANGYueＧxing１,＃,WUKun２,＃,FANGYunＧxia１,CHENHongＧqi１,NIShen１,FUXiangＧdong２,ZHUXuＧdong１,∗(１StateKeyLaboratoryofRiceBiology,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou３１０００６,China;２InstituteofGeneticsandDevelopingBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing１００１０１,China;＃Theseauthorscontributedequallytothispaper;∗Correspondingauthor,EＧmail:ricezxd＠１２６．com)WANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,etal．Geneticanalysis,genemappingandbreedingapplicationofsmallgrainanddensepaniclemutantsep１inrice．ChinJRiceSci,２０１４,２８(３):２２９Ｇ２３４．Abstract:By６０CorＧrayradiation,asmallgrainanddensepaniclemutantsep１wasobtainedfromtheindicavarietyShuangkezao．ComparedtothewildtypeShuangkezao,itwasamutantwithsmallergrain,shorterspikeＧstalkbutmoregrainnumberperpanicle．Thehistologicalsliceobservationofthemainstemshowedthatthemutanthadmorevascularbundlenumberinonecycleandmorecellnumberperunitareathanthewildtype．Geneticandallelismanalysisresultsshowedthatthesmallgrainanddensepaniclemutantwascontrolledbyarecessivegene,anditwasdifferenttothedensepaniclegeneswhichhadbeenalreadycloned．ThenbyconstructingthegeneticsegregatedpopulationandusingtheInDelmarkers,thesmallgrainanddensepaniclegenewasmappedonthecentromericregionofchromosome５betweenmarkerXP２６Ｇ２８andXP２６Ｇ３１．Inaddition,thebreedingapplicationofthemutantwascarriedoutonCMSlinesandthestabilelinesofhighgenerationshadfinallybeenobtained．Keywords:rice;smallgrainanddensepanicle;geneticanalysis;genemapping;breedingapplication王跃星,吴昆,方云霞,等．水稻小粒密穗突变体sep１的遗传分析、基因定位与育种利用．中国水稻科学,２０１４,２８(３):２２９Ｇ２３４．摘要:通过６０Co衰变产生的r射线辐照籼稻品种“双科早”,获得小粒密穗突变体sep１,该突变体与野生型双科早相比表现为籽粒变小,穗轴变短,着粒密度增加.主茎切片观察结果显示,突变体维管束数和单位面积细胞数均比野生型多.遗传分析和等位性分析结果表明,该突变体为隐性突变,与已克隆的直立密穗基因不等位.利用InDel分子标记将小粒密穗基因sep１定位在第５染色体着丝粒附近的两个标记XP２６Ｇ２８与XP２６Ｇ３１之间,物理距离约为３．８９６Mb.此外,还利用该突变体开展了相应的育种利用研究,已获得高代稳定的不育系材料.关键词:水稻;小粒密穗;遗传分析;基因定位;育种利用中图分类号:Q３４３�５;S５１１�０３５文献标识码:A文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１４)０３Ｇ０２２９Ｇ０６禾谷类作物穗的构成主要包括籽粒大小和穗的形态,二者直接决定最终的产量.穗型是水稻育种上一个重要的农艺性状,其主要由一次和二次枝梗的形态、数量和长度决定.粒形和穗型作为水稻理想株型的重要性状,对于水稻产量增加起到了至关重要的作用,已受到越来越多育种家的重视.国内外已有报道发现并完成定位克隆的直立密穗基因有DEP１(qPE９Ｇ１)、DEP２(EP２)、DEP３和EP３等.这些基因大多来自粳稻品种或品系.其中,DEP１位点是一个控制水稻产量性状的主效QTL,该位点在品种驯化过程中发生突变,产生的dep１能导致稻穗变短、直立、着粒密集[１Ｇ４].dep２收稿日期:２０１３Ｇ１２Ｇ１３;修改稿收到日期:２０１４Ｇ０２Ｇ２１.基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y１２C１３０００９);国家９７３计划资助项目(２０１３CBA０１４０１).９２２中国水稻科学(ChinJRiceSci),２０１４,２８(３):２２９－２３４．ricesci．cnDOI:１０．３９６９/j．issn．１００１Ｇ７２１６．２０１４．０３．００２是一个来自中花１１和日本晴的直立密穗突变体[５].DEP２编码一个目前功能未知的植物特有蛋白,主要在幼嫩组织(尤其幼穗)中表达.形态和表达分析表明DEP２主要影响穗轴和一、二次枝梗的伸长,但并不减弱穗原基的分化和形成.DEP２与小圆粒基因srs１和EP２为等位基因[６Ｇ８].dep３也来自粳稻,其穗从开花到完熟都保持直立状态,与野生型稻穗在花后就开始下垂的形状明显不同.此外,dep３突变体的穗长、粒形以及每穗粒数等性状也发生改变.与野生型相比,dep３突变体的维管束更小、茎更粗,这解释了穗直立的表型[９].EP３是使用NＧ甲基ＧNＧ亚硝基脲处理粳稻品种Hwasunchalbyeo,获得一个直立穗突变体hep,遗传分析表明该表型受一个隐型突变基因ep３控制.ep３突变显著增加了小维管束的数量和穗轴的粗壮度,这是产生直立穗表型的原因[１０].本研究通过r射线辐照籼稻品种“双科早”获得了１份小粒密穗突变体sep１(smallgrainanddensepanicle１,sep１).本研究对该突变体的表型、生理特征以及主要农艺性状进行了观察,并对sep１进行遗传分析和基因定位,为该基因的克隆、功能分析奠定基础.同时,开展了sep１在不育系育种中的应用,以期利用该突变等位基因来培育优质高产小粒不育系,起到提高制种效率和节本增效的作用.１材料与方法１．１供试材料利用６０Co衰变产生的r射线辐照籼稻品种“双科早”,获得了大量的形态突变体.其中,sep１突变体表现为小粒和密穗性状.于２０１１和２０１２年将sep１突变体与野生型种植于中国水稻研究所富阳试验基地,成熟期调查３株的株高、穗长、结实率、粒长和粒宽等农艺性状,取平均值.１．２突变体的遗传分析与育种利用突变体基因遗传分析群体为sep１与粳稻品种日本晴、美国品种L２０４的F１及F２群体,配置正、反交.利用sep１与光舒(直立穗粳稻)杂交考查其与已经定位基因DEP１的等位性关系;利用sep１与日本晴的F２群体中小粒密穗分离单株对突变体基因开展定位研究.将sep１与华粳籼７４、稻花香２号、中６４B和中巧B等配组,获得育种利用群体(F２,F３和回交群体等).对上述各世代材料实行单本移栽,逐株考查单株表型分离情况,在考查直立密穗突变体的同时考查分析直立密穗突变体后代分离的遗传特点.１．３突变体组织切片观察取野生型和突变体的茎秆用FAA固定液固定、保存.石蜡切片制作方法参见文献[１１].１．４突变体的基因定位亲本、F１及F２遗传群体植株的基因组DNA采用CTAB法[１２]提取.通过NCBI(．ncＧbi．nlm．nih．gov)公布的粳稻日本晴和籼稻９３１１的全基因组序列差异寻找插入/缺失(InDel)位点,利用PrimerPremiers５．０软件设计InDel分子标记(表１,引物由上海英俊生物技术有限公司合成).将提取的DNA用于PCR扩增实验,PCR体系如下:DNA１μL,正反向引物(１０μmol/L)各０．５μL,表１本研究中用于定位的分子标记Table１．Molecularmarkersformappinginthestudy．标记Marker正向引物序列Forwardprimersequence(５′Ｇ３′)反向引物序列Reverseprimersequence(５′Ｇ３′)物理位置Physicalposition/bpXP２６Ｇ２１CCACCGAAACATAAACATCATCTGGGTTTGTGAATTGAGAAT６４０２５１４XP２６Ｇ２４AAAGCCACCTAATAGAATCAAACCATTTGGAGCGGATAGTC７２３５４９６XP２６Ｇ２７TACGAAATGGACAAGATAGCACGCTTACTTTCTTCTGGGTGATA８９０２３９１XP２６Ｇ２８GCTTCAAAACAATCATCATATCAGTCAAAACGTAGGTACTTCAG９７１０８８１XP２６Ｇ２９AAATTGGTTCGTCGCTGGTTAAAACGGAAAACCAAGGGGAAA１１８９６２１０XP２６Ｇ３０AATAGTTATTCTAGGGGAGGGGCCATTTCATTCCATTTTCATACT１２６９８１８１XP２６Ｇ３１GCCAAAGAATCCAGCACCCCTTTTCGTTCCCCACCATCCAC１３６０６３７６XP２６Ｇ３３CTCCCTTCCATCGCCACAATCCAAACTCGAAACCGACAAA１４８４１０６０XP２６Ｇ３５GATAACCGTGCTGTCTCCCCCGCGATACGTTTGTACACCG１５０７８７４６XP２６Ｇ４１GGATCGAAAGAAACAAAATAGTAGTCCCACGTAAATACAGAAAC１６９０４０８５XP２６Ｇ４２TCCAGGTGATAAGAAAGTGAATGAATGTTGAGTGGTATGCGATGA１７０２２９２３０３２中国水稻科学(ChinJRiceSci)第２８卷第３期(２０１４年５月)表２双科早及其突变体sep１株高和穗相关性状Table２．ComparisonofplantheightandpanicletraitsbetweenShuangkezaoandthemutantsep１．材料Material株高Plantheight/cm穗长Paniclelength/cm每穗粒数No．ofgrainsperpanicle结实率Seedsettingrate/％粒长Grainlength/mm粒宽Grainwidth/mm双科早Shuangkezao９６．２±２．５２３．３±１．０２０８．３±８．７７０．１±２．０９．１±０．１２．５±０．２sep１８６．３±２．２∗∗１９．０±０．９∗∗２２５．５±１０．５∗６９．２±０．７６．４±０．２∗∗２．５±０．２２０１１和２０１２两年数据