基因工程工程菌构建

1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建生物技术1101班李娟1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展方向。1，3．丙二醇简介1，3-丙二醇性质•物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相对密度为1．053g／cm3，熔点．27℃，沸点211℃，自燃温度为400℃。•化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。1，3-丙二醇用途•可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业14j。•1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品，产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标•本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆1．16kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌iJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhD)构建重组载体pUC．tac．dhaT，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建重组菌EcoliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考察其转化甘油的能力。(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac—dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。(3)在摇瓶水平，对已构建的产1，3．丙二醇重组菌EcoliJMl09发酵条件的初步研1，3．丙二醇生物合成途径l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇。一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达1，菌株、质粒及基因片断：大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。2，主要试剂：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化试剂盒；工具酶、抗生素；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、材料（一）、质粒DNA的提取(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培养过夜。(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／min离心5min。(3)弃去上清，加入溶液I100“L重悬菌体。(4)加入溶液II150“L，轻柔混匀。(5)加入溶液III150此，倒转混匀，8000r／min，离心10min。(6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。(8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000r／min离心2min。(9)取5“L酶切后电泳鉴定。(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。(2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4。(3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟。(4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。(5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL，轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。（6)重复步骤(5)两次。(7)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL。也可加40uL50％的甘油保存代用。（三）、转化大肠杆菌(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。(2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可用漩涡混合仪。(3)冰水浴40min。(4)42℃热激90s。(5)加入1mLLB培养基，37℃震荡培养1．2h。(6)涂布含有相应抗生素的LB平板。（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtac-yqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大肠杆菌JM109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)。（五）、酶活力测定1、甘油脱水酶活力的测定2、1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力测定（六）、1，3．丙二醇含量的测定发酵液中l，3：．丙二醇及甘油的含量采用气相色谱测定，国产高分子微GDX．401(110目)为固定相。柱温：250℃，进样温度：240℃，检测温度t240℃，氮气作为载气，使用氢火焰检测器，进样5“L，1，3．丙二醇的保留时间为2．7min左右，用外标法计算发酵液中1，3一丙二醇的含量。二、重组质粒pUC—tac-dhaT的构建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达实验材料菌种：EcoliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本研究“第二章构建保存的；质粒pUCl9，pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒工具酶、抗生素公司、华美生物；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、3PCR引物根据克雷伯氏菌公布的序列，。引物：3PCR引物根据克雷伯氏菌公布的序列，设计片段pEtac．dhaTPCR所需引物：Ps：5’-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3’：P6：5'-ACCCAGAATGCCTGGCG．3’。引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。实验条件和方法PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：在05mLEppendorf管中按顺序加入以下试剂：10×buffer5m，25mmol／LdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1IIl，模板DNA2pl，脚酶1itl，ddH2032m，总体积50pl。1．3一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件：94℃预变性5min：变性90s，54℃退火l5min，72℃延伸l5rain，循环35次；72℃保温10min。（1）大肠杆菌基因工程菌的构建将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体pEtae，以得到的重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tac-dhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。（2）1，3．丙二醇氧化还原酶的酶活力测定测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活。酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量。四、重组菌coliJMl09(pEtac—dhaB—tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)发酵培养基优化菌株：重组菌EcoliJMl09(pEtac．dhaB-tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)为本论文三中构建。培养基和培养条件LB培养基(∥L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠lO，琼脂15(固体培养基)，固体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100}tg／mL、卡那霉素50p．g／mL。种子培养基：采用LB培养基。发酵培养基(g／L)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS04·7H20和维生素B12青霉素至100Ixg／mL、卡那霉素50rtg／mL。材料摇瓶发酵：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入50mL摇瓶(装液量为10mL)中，于旋转式摇床中37℃、150r／min培养18h得到种子液。接种于250mL摇瓶中，在150r／min旋转式摇床中，先于37。C培养至OD600为O．7，再于37℃诱导发酵一定时间。方法1、采用单因素实验分别考察了不同浓度的甘油、酵母膏、KH2P04、VBl2及M孑+等因素对重组菌EcoliJMl09(pEtac．dhaB—tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)发酵结果的影响，确定了其发酵培养基的基本组成为：甘油20g／L、VBl20．01g／L、KH2P047．5edL、M92+0．67g／L和酵母膏5∥L，在此培养基中l，3一丙二醇的产量达到2．25∥L。小结2、通过正交实验分析法进一步优化了重组菌EcoliJMl09(pEtac-dhaB．tac-yqhD，pUC—tac-dhaT)的发酵培养基，其适宜组成为：甘油20g／L、VBl2O．01g／L、KH2P045g／L、M92+0．67edL和酵母膏5∥L。最适发酵条件为：装液量10％、接种量10％、转速150r／min、接种后4d,时左右加入IPTG、IPTG终浓度为lmmol／L。应用此培养基l，3．丙二醇的产量为2．4329／L，3、在通过正交实验优化后的培养基中，重组菌EcoliJMl09(pEtae—dhaB．tac-yqhD)与EcoliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD，pUC．tac—dhaT)经诱导前后1，3．丙二醇的产量分别为0．3∥L、1．943g／L及O．3∥L、2．432g／L。发酵24小时后，重组菌EcoliJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhDDpUC—tac—dhaT)L[',EcoliJM109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)l，3·丙二醇产量提高了25．1％。可见，由甘油到1，3-PD的反应，限速步骤是3．羟基丙醛到1，3。丙二醇的反应。本研究成功构建了在大肠杆菌中利用了两种辅酶(NADH、NADPH)的共表达，减少3．羟基丙醛的累积，提高了1，3-PD的产量。