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黄瓜转基因技术体系及相关基因转化研究进展黄瓜的营养价值：1.抗肿瘤：黄瓜中含有的葫芦素C具有提高人体免疫功能的作用，达到抗肿瘤目的。此外，该物质还可治疗慢性肝炎和迁延性肝炎，对原发性肝癌患者有延长生存期作用。2.抗衰老：黄瓜中含有丰富的维生素E，可起到延年益寿，抗衰老的作用；黄瓜中的黄瓜酶，有很强的生物活性，能有效地促进机体的新陈代谢。用黄瓜捣汁涂擦皮肤，有润肤，舒展皱纹功效。3.防酒精：中毒黄瓜中所含的丙氨酸、精氨酸和谷胺酰胺对肝脏病人，特别是对酒精性肝硬化患者有一定辅助治疗作用，可防治酒精中毒。4.降血糖：黄瓜中所含的葡萄糖甙、果糖等不参与通常的糖代谢，故糖尿病人以黄瓜代淀粉类食物充饥，血糖非但不会升高，甚至会降低。5.减肥强体：黄瓜中所含的丙醇二酸，可抑制糖类物质变为脂肪。此外，黄瓜中的纤维素对促进人体肠道内腐败物质的排除和降低胆固醇有一定作用，能强身健体。6.健脑安神：黄瓜含有维生素B1，对改善大脑和神经系统功能有利，能安神定志，辅助治疗失眠症。黄瓜是我国主要的蔬菜作物之一，是我国保护地栽培面积最大的蔬菜作物。黄瓜在生长过程中极易遭受各种病虫害及不利环境的影响．黄瓜的产量和品质大大降低。选育优良品种是解决这些问题的关键，但由于现有种质资源的限制，采用常规育种方法很难在一些性状上有大的突破。随着生物技术的发展及其在农业领域的广泛应用。应用基因工程技术有目的地改良性状，特别是采用常规育种方法无法改良的性状，创造黄瓜育种新种质，为黄瓜育种技术的创新提供了新的途径。背景1.转化方法早期的遗传转化是以发根农杆菌为工程菌介导的,Tmlson等采用发根农杆菌感染下胚轴但由于毛状根再生的频率太低只得到几株再生植株。随后施和平等采用发根农杆菌研究了黄瓜子叶外植体毛状根再生的情况。除此之外，未见更多的使用发根农杆菌对黄瓜进行遗传转化的报道。根癌农杆菌介导的遗传化，因转化机理研究比较清楚转化效率相对较高目前为多数研究者所采用是进行黄瓜转基因研究的主要方法。许多研究者对影响黄瓜遗传转化体系的因素进行了研究，如农杆菌菌株、质粒载体的类型、细菌侵染浓度、感染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度及使用方法、抗生素种类及浓度、筛选标记等。旨在建立成熟的转化体系，将目的基因有效导入黄瓜。但这些转化方法的外植体材料需要经过严格的培养与再生过程才能获得转基因植株。步骤繁琐，周期长。因此，研究者也一直在探索避开组织培养的简单、有效的转化途径如：电击法、基因枪法、花粉管通道法。但这些方法虽操作简单，转化率却相对较低，转化机理尚不清楚。2.目的基因主要针对与黄瓜抗病(真菌病害、病毒病)、抗虫、抗逆、品质、产量等相关性状基因进行转基因研究。2．1抗病毒基因病毒病是黄瓜主要病害之一。转入病毒外壳蛋白编码基因是抗病毒转基因黄瓜研究中应用较早和技术较为成熟的方法。利用病毒外壳蛋白编码基因转入植物．可以使病毒外壳蛋白在植物细胞中积累。能够抑制侵染病毒的复制，从而减轻症状或推迟病毒发生的时间。Chee等将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)转入黄瓜，转基因植株抗性增强；王慧中等将西瓜花叶病毒外壳蛋白基因(WMV-2CP)转入黄瓜，转基因植株可延迟发病时间，减轻发病程度(Gal-On等)pu.tative54-kDareplicasegene转入黄瓜，转基因植株接种CFM-MV病毒。植株抗性达免疫程度，而且抗根部侵染。黄瓜病毒病又名花叶病，主要危害叶和瓜2．2几丁质酶基因黄瓜在保护地栽培中极易受到真菌病害侵袭。严重影响黄瓜产量和品质，如白粉病、枯萎病、灰霉病等。植物几丁质酶因能水解真菌细胞壁的主要成分几丁质。在抗植物真菌病害反应中发挥了重要的作用。来自日本的研究小组多年来深入研究了几丁质酶基因对提高黄瓜抗真菌病害的作用：Kishimoto等将来源于水稻的classI几丁质酶基因转入黄瓜。发现转基因植株叶表皮及叶肉内几丁质酶基因表达量上升。田间试验表明，植株抗灰霉病，抗疫霉病菌，但不抗枯萎病；Kishim-oto等又进行classIII几丁质酶基因转化黄瓜研究。接种灰霉病病菌后发现，感染后4d内抗性明显高于对照，但随后发病。2．3甜蛋白基因植物甜蛋白是从植物中发现的一类具有甜味的蛋白质。植物甜蛋白具有许多优点：甜度高，低热量，无毒安全。甜蛋白提取自热带植物Tdaniellii中，产量低，不能满足市场需要，于是研究者开展了Thaumatin的基因工程研究。Thaumatin基因已被用来转化多种微生物，真菌和高等植物。波兰研究小组多年来一直进行黄瓜Thaumatin基因转化研究，用于黄瓜果实品质改良：Malepsz等将preprothaumatinII基因转入黄瓜，发现prer-othaumatinII在叶片、茎和果实中均有表达，果实有甜味，同时发现植株对霜霉病有抗性；Kiekiewicz等田田间调查发现。转甜蛋白基因植株对蚜虫、螨类、蓟马的吸引力明显降低：Szwacka等鲫用35S启动子，将甜蛋白基因转入黄瓜．并研究了甜蛋白在不同器官、不同时期的表达差异。I'llaumatin基因已被用来转化了数种微生物、真菌和高等植物。2．4单性结实相关基因提高栽培品种的单性结实能力，对于设施栽培条件下黄瓜正常结实．保证产量及商品性具有重要意义。由于果实发育与IAA直接相关，增加花芽中IAA水平。可促进单性结实果实的发育和增加果实的产量。色氨酸单加氧酶(IAAM)是IAA生物合成中吲哚乙酰胺途径的关键酶。其编码基因话iaaM已被克隆。利用iaaM转化植株。已成功改良许多农作物品种。目前应用最多效果最好的是DefH9一iaaM嵌合基因。其中的话iaaM基因编码区分离自萨氏假单孢菌．它还包含了在子房中特异表达的DefH9启动子。Yin等将DefH9-iaaM基因转入黄瓜，转基因株系中70％一90％可单性结实，且所结籽粒较小。苏绍坤等转化协iaaM基因，果实经检测80％为单性结实。生长素结合蛋白(ABPl)为生长素受体，将编码该蛋白的基因转入植物体．植物体内生长素结合蛋白含量提高，能促使植株对生长素的敏感性增强。白吉刚等吲转化生长素结合蛋白基因(ABP1)发现，转基因植株果实单性结实能力明显提高。2．5抗寒相关基因研究发现植物中存在许多不同的转录调控途径，能够使一些基因的表达被逆境胁迫诱导．从而对胁迫作出响应，其中转录因子是参与转录调控途径的蛋白质。DREB类转录因子是AP2，EREBP转录因子家族的一个亚家族，能够特异性地与抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件相结合．在低温、干早和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达，是逆境适应中的关键性调节因子。其中DREBl／CBF类成员已在拟南芥、小麦、烟草、油菜等作物中鉴定主要参与低温胁迫应答反应。邓小燕等转录因子CBF3转入黄瓜。获得了转基因植株。纪巍等陶将受干旱、高盐、低温等胁迫信号诱导的rd29A启动子和组成性表达的35S启动子驱动的DR耶JA基因转入黄瓜中，分别获得PCR检测阳性株．而且观察到rd29A启动子驱动得到的植株性状表现更好。2．6花器官发育相关基因黄瓜雌花节位的高低是影响产量的主要因素，选育强雌或全雌性品种是目前黄瓜育种的主要目标之一。同时研究黄瓜花发育的分子机制具有重要的理论意义。乙烯可强化高等植物的雌性表达。ACC合酶(ACS)是乙烯生物合成过程中的关键酶，研究表明ACS基因可能与F基因（控制雌性表达）有关。李泠等从黄瓜中克隆到的ACC合酶(ACS)基因转入黄瓜，获得转基因植株，发现转基因植株的性型表现较复杂。MADS-box是调控黄瓜性别发育的另一类基因家族。已经从黄瓜中分离得到很多MADS-box基因，它们与器官的成熟早晚、产量及品质密切相关。赖来等l刎报道了将从黄瓜中克隆到的MADS-box同源基因CSMADs06．转化到不同品系的黄瓜S06和S52中，可获得抗性植株。2．7抗除草剂基因抗除草剂基因在植物遗传转化中多用作选择标记，同时又可用来做转化的目的基因。金红等闯将除草剂6ar基因转入黄瓜，同时利用转基因纯合株系为父本与非转基因母本杂交。对其后代进行杂交种纯度鉴定．对转基因植株及杂交组合后代进行除草剂喷雾．结果表明转基因植株84％表现较高抗性。杂种纯度鉴定准确率达100％。2．8功能食品相关基因促胰岛素基因：王翠艳等将GAD-GLP-l和多拷贝长效GLP-1基因。成功转入黄瓜，并完成分子及药效检测，有望进一步结合常规育种培育食用功能型黄瓜预防和治疗糖尿病。抗衰老基因：ke等pq转化木薯的超氧化物歧化酶基因（Superoxidedismutase.S-OD），期望利用黄瓜作为生物反应器，产生抗衰老的SOD，SOD活性检测表明从转基因植株上收获的黄瓜果实中的SOD活性是未转基因黄瓜的3倍。3黄瓜转基因植株安全性评价转基因食品的安全性一直为社会所关注，主要包括食用安全与环境安全。黄瓜作为加工与鲜食为主的蔬菜。转基因植株及果实的安全性更为研究者所重视。研究者Koga-Ban等将几丁质酶基因转入黄瓜，获得抗灰霉病转基因黄瓜，分别从以下几方面进行安全性研究：植株和果实的形态学特点育性对环境产生可能的为害性土壤微生物群落的影响农杆菌残留。结果表明除了几丁质酶基因表达和灰霉病抗性表达外．发现与非转基因植株无差异。4问题与对策研究者对黄瓜转基因研究进行了多年坚持不懈的努力，取得了很多进展。但依然存在以下问题。黄瓜农杆菌介导的遗传转化效率较低，如要获得育种应用的优良株系，需要进行大量外植体的转化工作，工作量较大。目的基因分散筛选标记问题，几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因，如抗生素或除草剂抗性伴随转基因技术的不断发展和成熟，相信转基因植株的安全性问题将会得到良好的解决，另外，消费者、生产者及管理机构将更能接受转基因食品。转基因技术将在黄瓜育种中发挥更重要的作用。谢谢大家！