化妆品的微生物学检查

化妆品的微生物学检查主要内容•化妆品的卫生标准•化妆品微生物学检查基础知识•化妆品中微生物总数检查•化妆品中控制菌检查化妆品原料中的微生物•0级酸、碱、醇等，本身具有杀菌功能，无需检测•1级无水脂类、矿物油、凡士林、硬脂酸等，含极少量微生物，本身中等抗菌能力，只需一次检查；•2级原料含少量微生物，被水稀释后能成为微生物营养物，如甘油、山梨醇等，一年检查一次；•3级具有微生物污染风险。表面活性剂、增泡剂、水解蛋白溶液、芦荟胶。需防腐体系。每批抽样检查•4级极高微生物污染风险，去离子水。化妆品微生物污染途径•一级污染•二级污染防止微生物污染的措施•3个操作因素：消毒、清洁措施、员工培训；•5个工程因素：设备、厂房、仓库、水系统和空气系统的良好的可消毒设计。•执行HACCP，消毒标准的建立赢包括工厂的每一个区域和相关的功能设施。化妆品微生物检验•原料和产品中的微生物数量是否达到执行标准；•检验用于化妆品和药品中的防腐剂的防腐效能检验方法•APC法：好样平板计数法•防腐剂效能实验检验方法可靠性•精确性——实验人员的实验技能•灵敏性、准确性——试验方法的合理性目前参照执行的方法•USP法（美国药典）•CTFA法（美国化妆品、盥洗用品及香料协会）•ASTM法（美国检验方法及材料协会）•英国药物学方法•GB7918.1-87•相同点：测试微生物种类和恢复系统、测定APC方法相同。•不同点：培养温度、接种物的制备程序、培养时间一、2007版“化妆品卫生规范”粘膜用、婴儿及儿童用化妆品眼部及口唇等细菌菌落总数不得大于500CFU/mL或500CFU/g。其他化妆品细菌菌落总数不得大于1000CFU/mL或1000CFU/g所有化妆品霉菌和酵母菌总数不得大于100CFU／mL或100CFU／g每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。二、检查的必备知识•1.采样–采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL作为检验量。–样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。–接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。–若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。–在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。–如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。2.供检样品（供试品）的制备•水溶性液体样品样品10mL90mL生理盐水1:10供试液2.供检样品（供试品）的制备•油性液体样品②5mL灭菌液体石蜡1:10供试液③10mL灭菌吐温8040~44℃①10mL样品混匀10min④75mL40~44℃灭菌生理盐水40~44℃乳化均质器2.供检样品（供试品）的制备–亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品振荡②90mL生理盐水①10g样品15min上清液作为1:10供试液膏、霜剂若用均质器，混合均质1~2min即可。2.供检样品（供试品）的制备–疏水性半固体样品②5mL灭菌液体石蜡1:10供试液③10mL灭菌吐温8040~44℃①10mL样品混匀10min④75mL40~44℃灭菌生理盐水40~44℃乳化均质器膏、霜剂若用均质器，混合均质3~5min即可。2.供检样品（供试品）的制备–固体样品振荡②90mL生理盐水上清液作为1:10供试液①10g样品15min三、细菌、真菌总数检查•1.意义–测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆品中的繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供科学依据。检查菌培养基名称培养温度培养时间细菌卵磷脂、吐温80-营养肉汤琼脂36℃±1℃48h±2h真菌虎红琼脂28℃±2℃72h±2h3.平皿法数据处理混合平板的制备细菌、真菌的培养检查结果、观察与计数供试液的制备书写检验记录单细菌、霉菌和酵母菌计数的操作过程对照对照对照对照1.0ml倒置培养48h±1h36℃±1℃卵磷脂、吐温80-营养肉汤琼脂28℃±2℃虎红琼脂倒置培养72h±2h9.0ml稀释液10g/ml供试品9.0ml10-210-11.0ml操作注意事项•1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。•2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。•3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。•4.注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。操作注意事项•5.为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。•6.为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。菌落计数及报告方法•宜选取细菌、酵母菌平均菌落数30~300之间、霉菌平均菌落数5~50之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。•（1）当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数;•（2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数菌落计数及报告方法•（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之;•（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之;•（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；•（6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU;例次不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g)报告方式(CFU/mL或CFU/g)10-110-210-31136516420-1640016000或1.6*10422760295461.63800038000或3.8*10432890271602.22710027100或2.7*1044不可计4650513-513000513000或5.1*105527115-270270或2.7*1026不可计30512-3050031000或3.1*1047000-1*10控制菌检查•（1）阴性对照试验：应无菌生长。•（2）阳性对照试验：供试品+阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。•（3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。供试品增菌培养分离培养纯培养染色镜检生化反应试验报告结果1.增菌培养目的•使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。2.分离培养目的•经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。3.纯培养目的•只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。4.染色镜检目的初步鉴定，观察细菌的形态大小。5.生化试验目的最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。粪大肠菌群•粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。•粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。产酸：黄色产气：气泡双倍胆盐乳糖MEMB琼脂液面玫瑰红色紫黑色靛基质试验粪大肠菌群检查结果报告•根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。铜绿假单胞菌•铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。•铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。最终结果判断增菌培养供试液的制备书写检验记录单分离纯化无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液革兰染色、镜检→氧化酶试验绿脓菌素试验生化试验硝酸盐还原试验42℃生长试验明胶液化试验SCDLP培养基十六烷三甲基溴化铵琼脂36±1℃18~24h36±1℃18~24h特征菌落灰白色、扁平、周围有水溶性蓝绿色素灰白色湿润黄绿色菌膜粉红/紫红色十六烷三甲基溴化铵平板SCDLP培养基氧化酶试验绿脓菌素试验盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色硝酸盐还原产气试验明胶液化明胶培养基（高层）明胶液化试验铜绿假单胞菌检查结果报告•被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌•金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。•金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脏性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。革兰染色、镜检→生化试验:血浆凝固酶试验甘露醇发酵试验最终结果判断增菌培养供试品的处理书写检验记录单分离纯化无菌落或无特征菌落配培养基和稀释液36±1℃36±1℃SCDLP培养基或7.5%NaCl肉汤24±2hBairdParker’s或血琼脂24~48h特征菌落灰黑色、边缘有浑浊带、周围有透明带金黄色葡萄球菌检查流程图灰/黑色BairdParker’s平板甘露醇发酵试验血浆凝块液态血浆血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌检查结果报告•凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。霉菌和酵母菌•霉菌和酵母菌数测定（Determinationofmoldsandyeastcount）是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。•本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃±2℃培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。操作步骤•样品稀释同菌落总数测定•取1：10、1：100、1：1000的检液各1mL分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至45℃±1℃左右的虎红培养基，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置28℃±1℃培养72h±2h，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h±2h应及时将此平板取出计数。•计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在5个～50个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g（mL）表示。