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第二章微生物检验的基本程序Microorganismexaminationprocedures采集样品选择参考菌群样品保存样品处理检验前准备细菌总数大肠菌群致病菌分离培养增菌分离培养纯化动物试验血清学试验染色镜检其他试验生化试验报告微生物检验一般程序图一、检验前准备PreparationforMicroorganismExamination1.准备好所需的各种仪器2.准备好所需的各种玻璃器皿3.准备好所需的各种试剂、药品、培养基4.无菌室灭菌5.检验人员的工作衣、帽、鞋、口罩等灭菌后备用二、样品的采集Sampling在产品的检验中，样品的采集和处理是任何检验工作中最重要的组成部分。关系到结果的准确性和检验机关决策的正确性。采集的样品必须具有代表性，即所取的样品能够代表产品的所有成分。科学的取样方案和正确的样品制备方法是必不可少的条件。要了解产品加工的批号、原料的来源、加工方法、保藏条件、运输、销售中的各环节，以及销售人员的责任心和卫生知识水平等。无论采取何种方案，都要实行随机抽样1微生物限度检验的特殊性ParticularityoftheMicrobialLimitTesting（1）微生物限度检验对象的特性不确定性分布的不均匀性活体特征产品受外来微生物的污染，污染可有可无，可多可少；种类多样。依条件而定，非产品本身所固有。因此微生物限度检验对象是不确定的。污染是意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。一个批号内的产品有的被污染，有的不被污染，分布不均匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类复杂或单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性。以活的微生物作为检验对象也是其独特特性，不同菌种的生长率和死亡率不尽相同，检测结果只代表取样时的状态。2抽样对微生物限度检测的影响EffectofSamplingonMicrobialLimitTesting由于以上特殊性，抽样对微生物限度检测值将产生巨大的影响。当一批产品无污染时，抽样将不影响检验结果，当一批产品存在污染时，抽样的样本是随机变量，抽样的影响如下：抽样方法：不同的方法对批产品总体的代表性是不同的，测定值也是有差异的。如可疑样本与随机样本。抽样量：抽样量的多少对样本的代表性极为重要。抽样次数：3样品的种类SampleType样品可分为大样、中样和小样。大样：一整批样品中样：从样品各部分取得的混合样小样（检样）:分析用的样品。抽样量：指从全批产品（或全过程）抽取的单位包装。检验量：是指检验用量，是抽样量各包装的混合样品的一部分。检验量与抽样量是两种不同的范畴的量，抽样量大于检验量。4采样方法SamplingMethod•必须在无菌操作下进行•袋装、瓶装、罐装品，应采完整的未开封的样品•如果样品很大，用无菌采样器采集•固体样品：粉末状的边取边混，小块大包装品从不同部位的小块取样，大块整体样品从不同部位取样，兼顾表面和深度•半固体样品，用无菌勺从几个部位挖取•液体样品振摇混匀，用100mL无菌注射器抽取•冷冻品，保持冷冻状态根据检验目的，确定取样方案抽样：供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可疑污染或对有争议复验的原样品。从药品、瓶外观看出发霉、生虫及变质的药品不必再继续检验，直接判为不合格。检样：每次最少应分取二瓶（盒）以上的样品共10g或10ml。中药蜜丸至少应分取4丸以上共10g。(1)药品取样Drugsampling(2)食品取样Foodsampling中样一般为250克；小样一般25克。A、食品卫生学微生物检验的取样方案国际食品卫生委员会（ICMSF）方案美国食品药品管理局（FDA）方案世界粮农组织（FAO）方案B、食物中毒微生物检验的取样方案当怀疑发生食物中毒时，应及时收集可疑中毒源食品或餐具，同时收集病人的呕吐物、粪便或血液等。C、人畜共患病病原微生物检验的取样方案当怀疑某一动物产品可能带有人畜共患病病原体时，应结合畜禽传染病学的基础知识，采取病原体最集中、最易检出的组织或体液送实验室检验。可疑微生物检测病原体指示菌二级抽样方案三级抽样方案国际食品卫生规范委员会InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationforFood,ICMSF选择n值选择n值和c值美国食品药品管理局（FDA）联合国粮农组织（FAO）•由n、c和m组成•n是从一批被检查食品中抽取样品的数量，取样数•c是样品检测值超过指标值m的最大可接受抽样单位数，如果超过该值，则拒绝接受该批产品•m是每克样品中相关细菌的合格菌数限量，即指标值二级抽样方案•例如：n=5,c=0，m=0意味着有5个样品被检验某一病原体，如果有一个样品中含有该病原体，则该批产品不可接受。n=5,c=0，m=102意味着有5个样品被检验某一病原体，未见到有超过m值的样品，则该批产品可接受，即合格。有一个额外的参数，附加指标值M，用于区分可接受的临界值和不可接受的值在任何一个样品中，大于或等于M的值都是不可接受的根据被检测到的微生物的浓度，三级抽样方案将食品分成三级•若计数小于m，则可接受•若计数大于m，小于M，则处于可接受的临界处•若计数大于M，则可接受三级抽样方案例如：大肠杆菌的抽样方案可以是：n=5,c=2，m=10，M=100意味着有5个样品中有2个样品的大肠杆菌含量在10-100之间是可接受的。但是如果有3个样品中，大肠杆菌的含量在10-100之间则不可接受；或者仅有一个样品的含量超过了100，那么该批次食品不可接受。涉及健康危害水平的抽样方案及其应用条件微生物的危害类型抽样后，产品被处理和消费的条件降低危害危害无变化增加危害无直接健康危害三级法，n=5,c=3三级法，n=5,c=2三级法，n=5,c=1有健康危害低、间接（指示菌）三级法，n=5,c=3三级法，n=5,c=2三级法，n=5,c=1中等、直接、有限的扩散三级法，n=5,c=2三级法，n=5,c=1三级法，n=10,c=1中等、直接、潜在的广泛扩散二级法，n=5,c=0二级法，n=10,c=0二级法，n=20,c=0严重、直接二级法，n=15,c=0二级法，n=30,c=0二级法，n=60,c=0蛋制品的抽样方案蛋制品的抽样方案目标微生物抽样方案nc限量（g-1）mM需氧菌落计数3525×104106大肠菌群35210103沙门氏菌（普通种）2500-21000-22000-沙门氏菌（高危种）21500-23000-26000-（3）生产工序监测采样MonitorSamplinginmanagementprocess•车间用水：自来水从水龙头上采取冷却水，汤料用100mL无菌注射器抽取•台面、用具、从业人员：用5cm2,无菌采样板及5支棉签擦拭25cm2•空气:5个90mm平板置于车间四角和中部,开皿一定时间(5min),盖盖（4）采样数量和标签SampleSizeandSampleLabel•不同的食品和药品种类，采样数量各有不同•采样前或采样后，每件样品标记清楚，如品名、来源、数量、地点、采样人、采样时间。三、样品的送检Deliveryandsubmissionofsample（1）采集好的样品送检要及时，一般不应超过3h，否则应保持在1-5℃的环境中。（2）不得加入防腐剂（3）对于易死亡病原菌的样品，可采用运送培养基，如：小肠结肠炎耶氏菌、空肠弯曲菌可用Cary-Blair运送培养基（4）送检时，必须认真填写申请单，注明特殊要求以供检验人员参考。四、样品的处理SampleTreatment1、基本要求（1）需将供试品制备成供试溶液或悬浮液。供试液的制备不得改变污染微生物的数量和种类。（2）做多项检验（微生物、化学、药理）时：首先取出规定量的供试品供微生物学检验，其余部分做其他检验。（3）供试品收检后，应及时检验，否则，应存放在规定的储存条件下。（4）在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。（5）供试品的取样必须在净化条件下，无菌操作。（6）含有抑菌成分的供试品，消除抑菌成分的干扰。2、供试液制备的一般方法PreparationMethodsofTestingsolution（1）液体样品直接用吸管吸取准确用量，制成1：10的稀释液。含CO2的液体，覆盖灭菌纱布轻轻摇荡，待全部逸出后检验酸性液体用灭菌的碳酸钠调至中性后再检验（2）固体或黏性液体用灭菌容器称取检样，加至浴温45℃的灭菌生理盐水或蒸馏水中，震荡溶解，从稀释到接种一般不超过15min机械分散法（适用于固体及油性样品）电动匀质法研磨法整粒振荡法B冷冻样品0-4℃18h;45℃15minC粉状或颗粒状搅匀后称取，制成1：10稀释液A固体样品（3）油脂性样品乳化法适用于油脂性样品，在供试品中加入适量的乳化剂及稀释剂，在保温情况下混匀（机械分散法），使之成为均匀分散的乳浊液。3有抑菌成分的样品的处理•离心沉淀集菌法•树脂吸附法•加入灭活剂•薄膜过滤法五、样品的检验Examination（1）检验人员接到送检单后，立即登记，填写序号，按要求将样品保存，并积极准备条件进行检验。（2）按照国标法或根据不同的产品、不同的检验目的来选择适当的检验方法。检验菌落总数、大肠菌群、致病菌六、结果报告Report（1）样品检验完毕后，检验人员应及时填写报告单，签名后送主管人核实签字，加盖单位印章，以示生效。（2）一般阳性样品发出报告后3d方能处理样品；进口的阳性样品，需保存六个月方能处理，阴性样品可随时处理。