灭活剂、保护剂和免疫剂

第三章灭活剂、保护剂和免疫佐剂第一节灭活剂一、灭活与灭活剂1、灭活概念是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活2、灭活方法物理方法（不用）化学方法（常用）3、灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂二、常用灭活剂的灭活机理与应用(一)灭活剂种类1、甲醛溶液：①蛋白质②核酸烷基化（不加中断剂）2、烷化剂乙酰基乙烯亚胺（AEI）二乙烯亚胺(BEI)缩水甘油醛（使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代硫酸钠中断灭活）3、苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原5、β-丙酰内酯病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用.注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤粘膜有强烈刺激性如：甲醛、β-丙酰内酯甲醛溶液：•《规程》（2000）中的26种灭活疫苗•灭活机理：•灭活浓度：多数为0.1％～0.3％•灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。氨基甲基胺羧基亚甲基二醇单酯巯基亚甲基二醇甲醛醛基羟基羟基甲酚烷化剂（alkylatingagent）乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI)、缩水甘油醛•灭活机制：1.烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。2.与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。•优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetylethylenimine，AEI）•淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。•0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年•AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。•口蹄疫病毒液:终浓度0.05％，30℃8h,加2％硫代硫酸钠阻断2、二乙烯亚胺（binaryethylenimine，BEI）•市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月;•终浓度0.02%,加入2％硫代硫酸钠中断灭活。3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）•大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。•本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。•0～4℃3个月含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存10d。4、-丙酰内酯（－propiolactone）又名羟基丙酸--内酯•无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保存•水中溶解度37％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合•对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。•病毒灭活后，能保持良好的免疫原性•主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。三、影响灭活作用的因素1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛最常用。2、微生物种类和特性3、灭活剂浓度（一定要适合）4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致）5、灭活时间6、灭活PH值7、有机物存在第二节保护剂（稳定剂）保护剂：又称稳定剂（stabilizer），是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、血清制备等）保护剂用途（不同用途加不同保护剂,主要针对活的微生物或细胞）①菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂②细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO)DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂③疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖保护剂（protector）的分类分类：•（根据其作用机理）——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等•（根据其分子量大小）——高分子物质、低分子物质。•（按其化学性质）——复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物复合物脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等一些常用的冷冻干燥保护剂分类保护剂疫苗冻干保护剂组成1.营养液：•可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；•可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度2.赋形剂：•防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响•使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度3.抗氧化剂：•抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。①防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生物活性物质的损伤；②降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保持细胞的活力；③保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复苏和迅速修复自身。冻干保护剂作用机制二、影响保护剂效能的因素1、保护剂种类:根据微生物种类或者用途来添加不同种类保护剂。２、保护剂浓度：严格按照配方执行。３、保护剂配制方法：糖类不能用121℃高压灭菌处理。４、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M的影响。三、常用的冻干保护剂（稳定剂）明确不同种类微生物需要添加不同保护剂（一）细菌的保护剂①需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、1.5％明胶；②厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱脂乳或7.5％葡糖血清。注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒的保护剂①5%蔗糖脱脂乳；②马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。注意:微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌30~40min。2．明胶蔗糖保护剂明胶2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲1%~2%（g/m1）。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解，116℃高压灭菌30~40min；3．SPGA保护剂兽医生物制品常用的保护剂蔗糖76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。第三节免疫佐剂一、佐剂概念与作用机理1.佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质.以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样,具有免疫调节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。•注意:佐剂和免疫增强剂的关系?•有时佐剂也是免疫增强剂.作用特点：①明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。②用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。免疫佐剂作用机理①改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；②改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性；③延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。作用方式①抗原递呈（antigenpresentation）②抗原寻的（antigentargeting）③免疫调节（immunemodulation）作用机理①抗原递呈：指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。②抗原寻的（antigentargeting）指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。③免疫调节（immunemodulation）是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。1.按佐剂物理性质•颗粒型佐剂•非颗粒型佐剂2.按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）•微生物及其组分•非微生物物质3.按佐剂在体内存留的时间•贮存型佐剂（depottypeadjuvant）•非贮存型（non-depottypeadjuvant）佐剂的分类（一）颗粒性佐剂1．盐类佐剂氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。2．油水乳剂佐剂弗氏完全佐剂（Freund’scompleteadjuvant,FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）和矿物油白油佐剂。3．免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）4．蜂胶佐剂（propolis）5．脂质体佐剂（liposomes）。6．其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐剂和γ－菊粉等。（二）非颗粒性佐剂1．肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。2．表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）3．核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG4．含硫复合物类佐剂：左旋咪唑5．碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6．细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-IFN等。7．脂质分子类佐剂：脂多糖、VitA和VitE等脂溶性维生素8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。合成方法:（1）用铝粉加烧碱合成法2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2OA12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明矾加碳酸钠合成法2KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl氢氧化铝胶(铝胶）用铝粉加烧碱合成法：2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2OA12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收存于容器内，可约得600kg铝胶。取氢氧化铝干粉50～55kg，加入6万毫升沸水中，搅拌均匀;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，经30～60min后，加温水，边加边搅拌约至总量为35万毫升；用前加水稀释至100万毫升，温度约为80℃，盛装在一个缸内另一缸盛80kg烧碱，加水至100万毫升，加温至75℃两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH6.9土0.1，继续熟化3min，稳定pH6.9土0.1静置沉淀，弃上清后加入约5倍量软化水，搅拌洗涤、弃上清，如此3～5次，检查至硫酸盐合格为止。①氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。②氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要掌握好化合时的pH值。③贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期不超过3个月。④铝胶室温保存，以免破坏胶态。注意事项是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。一种好的乳剂疫苗应是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微