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PikoReal荧光定量PCR使用培训－致病菌检测2内容：1、荧光定量PCR基本原理介绍2、PikoReal功能简介3、致病菌检测实验操作及结果分析PCR和定量PCR——基本知识介绍4生命的遗传物质DNA（少数物种为RNA），对于不同的物种来说，其碱基排列顺序是独一无二的检测不同生物中特异的DNA片段，就可以清楚的区分不同的生物。5中心法则碱基配对原则6PolymeraseChainReaction（PCR）——聚合酶链式反应体外的DNA复制PCR反应体外RNA逆转录为CDNART-PCR反应通过PCR或RT-PCR反应，就可累计大量的特异性目的片段，用于下游的检测和研究7Melting94CPrimersBind58CExtension72CPCR的基本原理8PCR的基本原理PolymeraseChainReaction（PCR）——聚合酶链式反应9•在PCR反应过程中，升温，降温交替进行，循环往复——热循环•提供热循环环境的仪器——热循环仪（PCR仪）TemperatureTimeMeltAnnealCopyMeltAnnealCopyCycle1Cycle2PCR的基本原理10•模板（DNAorRNA）•DNA：从animal,plant,bacteria,yeast,virus中抽提•RNA：抽提后逆转录为cDNA(也在PCR仪上完成）•引物（一对或多对）•脱氧核糖核苷酸(dNTP原料)•热稳定的DNA聚合酶•Buffer（缓冲液提供适合的酶作用环境）•反应体系：5-50ul（常用）PCR的基本原理PCR反应体系PCRkit11PCR的基本原理PCR实验流程图:A模板，引物,dNTP,缓冲液,DNA聚合酶上样PCR反应12PCR的基本原理PCR实验流程图:B+-PCR产物电泳，EB染色13两种产物两对特定引物扩增的片段多种产物非特异性引物扩增出一系列片段PCR实验流程图:CPCR的基本原理凝胶成像系统成像，定终产物浓度–半定量14•PCR是当今应用最广泛的生物技术之一•几乎所有的分子生物学实验室，药物研发中心，临床诊断实验室都在使用PCR技术，而且还有新的应用方向不断开发出来几个重要的应用领域:•科学研究••医学研究及诊断••法医鉴定••食品检验PCR应用15PCR技术的优点与缺点缺点：•扩增与检测分开进行→繁琐•使用荧光染料EB检测DNA→有毒•不同实验室之间结果没有可比性•通量太低扩增检测16PCR技术的优点与缺点缺点：很难准确得到样本内模板DNA或RNA的量终点的产物量不一定能如实反应和起始模板量的对应关系相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图PCR反应进入平台期，合成新链的原料开始不足，酶的活力也下降，导致新增DNA的量增长缓慢，最后停止增长。17荧光定量PCR——基本原理——荧光染料和探针——应用介绍18光源荧光定量PCR——基本原理热循环仪探测器可以实时检测出每轮循环的PCR产物量加入荧光染料的PCR体系模板，引物,dNTP,缓冲液,DNA聚合酶和荧光探针或荧光染料20区别：普通PCR：可以粗略定出反应结束时终产物的量-半定量荧光定量PCR仪：可以精确测量出初始模板量21荧光定量PCR——荧光染料和探针•非特异性的荧光染料SYBRGreenI•特异性的荧光探针TaqMan22SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission非特异性荧光染料–SYBR-Green23SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission非特异性荧光染料–SYBR-Green24融解曲线分析（Tm）非特异性荧光染料–SYBR-GreenTm：50%的DNA产物解链时的温度一种DNA片段只有一个特定的Tm，所以通过溶解曲线分析，可以检验扩增的产物是否是目的片段Tm25非特异性荧光染料–SYBR-Green应用列举：酵母菌检测根据Tm值判断是否是酵母菌26RQSequenceSpecificProbes:Taqmanprobes5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationQQQExcitation特异性荧光探针–Taqmanprobes27特异性荧光探针–Taqmanprobes常用的标记探针的染料：第一通道：FAM第二通道：HEX第三通道：Rox第四通道：CY528致病微生物：沙门氏菌金黄色葡萄球菌单核细胞增生李斯特氏杆菌肠毒素大肠杆菌阪崎肠杆菌弯曲杆菌（禽类）肉毒梭菌志贺氏菌小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌副溶血弧菌创伤弧菌等均能把3-5天的检测时间缩短到一天之内特异性荧光探针–Taqmanprobes29单重和多重荧光定量PCR•单通道（单色）：一个PCR管里只做一个基因定量（多用SybrGreen）•双通道（两色）：一个PCR管里做两个基因的定量•多通道（多色）：一个PCR管里做三个以上基因定量常用FAMHEX30PikoReal功能简介31研发生产中心：位于芬兰Espoo32光源:5xLED•寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号•无需使用ROX染料进行光强校正探测器：CCD相机•能同时快速收集整板多重荧光信号数据•高灵敏度PCR模块：96孔半导体PCRPikoREAL的硬件系统:33功能：绝对定量双探针法HRM法相对定量基因型分析熔解曲线分析选配模块34五通道四色：激发波长(nm)发射波长(nm)预校正的染料475–500520–550FAM,SYBRGreen515–535557–590HEX,YakimaYellow570–590615–650ROX,TexasRed600–640666–740Cy5475–500520–590单色通道，HRM通道一个反应管里最多可同时检测4种不同的致病菌核酸35仪器特点：1、硬件组合优越，设计创新2、更加适合5-10ul小反应体系，成倍节省实验成本3、小巧、快速、稳定、安静无声36致病菌检测实验操作及结果分析37检测流程25g或25ml样品＋225ml预增菌培养液，混匀，适宜的温度下培养24小时取1ml培养液，加入裂解液，裂解细菌，释放核酸（45min）配制标准品，PCR反应液，加样（30min）定量PCR反应，查看并分析结果（1.5h）阴性：出结果报告阳性：继续用培养法验证结果两天内可出结果38检测项目GB中的名称OXOID的英文名称OXOID的中文名称OXOID货号规格沙门氏菌缓冲蛋白胨水（BPW）BufferPeptoneWater(ISO)缓冲蛋白胨水(ISO)CM1049B500gCM1049R2.5kgCM1049T5kg金葡菌10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤TryptoneSoyaBroth（SoybeanCaseinDigestMediumUSP）胰蛋白胨大豆肉汤（美国药典中大豆酪蛋白消化物培养基）CM0129B500gCM0129R2.5kgCM0129T5kg大肠埃希氏菌O157：H7/NM改良EC肉汤ECBROTH(ReducedBileSalts)EC肉汤（减少胆盐）CM0990B500g志贺氏菌GN增菌液GNBrothGN增菌液R453511100gR453512500gR4535142.5kgOXOID常用预增菌培养液：赛默飞咨询热线：800－810－51181、预增菌－按说明书操作392、细菌裂解，配制反应液及上样1）细菌裂解：获得待测样品。2）配制标准品：阴性对照样品，阳性对照样品（4个浓度）3）按检测样品量计算所需反应液的量4）配制所需反应液，混合均匀5）把反应液加入反应板，并分别在相应的孔加入阴性对照样品、阳性对照样品，待测样品。以下操作均按照检测试剂盒操作说明书进行：40检测试剂开放，可选择各国产及进口厂家试剂盒41以金黄色葡萄球菌的检测为例1、样品预增菌25g或25ml样品＋10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤37度，24小时金黄色葡萄球菌：StaphylococcusAureus(SA)42以金黄色葡萄球菌的检测为例2、细菌裂解，样品制备A、取1ml培养液，13000rpm离心2分钟B、去上清液，加入100ulDNA提取液充分混匀C、沸水浴加热10分钟（误差不超过1分钟）D、13000rmp离心5分钟，上清液备用（样品）试剂盒：Liferiver金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（荧光法）生产商：上海之江生物科技货号：DD－0041－02433、梯度标准品配制A、内部对照：取内部对照品4ul，加36ul水，震荡混匀后，3000rmp离心10秒，备用。B、10倍稀释标准品（如只需出阴阳性结果，则无需配制系列浓度的阳性标准品）1）取4只2ml离心管，分别标记为：2、3、4、5（浓度依次为：5×106、5×105、5×104、5×103拷贝/ml)。2）各管中分别加入36ul水3）取4ul阳性对照品加入1号管中，震荡混匀后取4ul加入2号管，2号管震荡混匀后取4ul加入3号管。依此处理4号管。444、反应液配制1（绝对定量法用)计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀绝对定量标准品：5(5个浓度，可定量出未知样品拷贝数）阴性对照：1未知样品：n（n为未知样品数）成分需要量（ul）SA核酸荧光PCR检测反应液（6＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（6＋n）×0.2ul×110％内部对照（6＋n）×0.5ul×110％•×110％是指多配10％，以补偿配制和加样过程中的损耗•如每个样品需要做2个或3个重复，则在各算式后再乘2或3即可454、反应液配制1(阴阳性判定法用)计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀，3000rmp离心10秒，备用。绝对定量标准品：1(1个浓度，作为阳性参照）阴性对照：1未知样品：n（n为未知样品数）成分需要量（ul）SA核酸荧光PCR检测反应液（2＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（2＋n）×0.2ul×110％内部对照（2＋n）×0.5ul×110％•×110％是指多配10％，以补偿配制和加样过程中的损耗•如每个样品需要做2个或3个重复，则在各算式后再乘2或3即可465、上样A、取一片96孔Piko板，放入上样辅助仪，每孔加入反应液18ulB、取裂解的样品，加入un孔，每种样品1孔；取稀释号的标准品，依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。unununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSununununununununununununununun0样品排列建议：S-阳性标准品、0–阴性对照、un–未知样品476、覆膜，离心，放入qPCR487、设置程序，点击Run启动PCR反应编程双击桌面仪器图标，打开软件492、点击New，新建一个运行文件，点击Protocol，进入程序编辑界面编程选中以上各步，可以修改，添加和删除反应步骤点击反白不需要检测的染料，输入反应体系。50编程添加新循环添加溶解曲线检测上下移动或删除反应步骤输入或输出反应程序开始运行程序添加一个反应步骤添加数据采集步骤51编程参数修改•左边选中要修改的步骤，右边相应的框中修改温度和时间•如要修改升降温速率，热盖温度，点击“AdvancedProperties”52点击Run启动PCR反应53状态监控电脑监控随时可以点击HOME，回主界面编辑新程序，分析已有实验结果。或进入PlateLayout进行板式设置。548、板布局点击PlateLayout，进入板布局界面，定位样品，输入名称，确定样品属性。-程序运行前，运行中，运行结束均可进行设置和修改告诉软件各反应孔的样品信息55板布局输入样品名称等信息样品分组孔信息拷贝，删除，粘贴，取消样品模块类型选择板布局输入，输出选择样品属性，分组，设