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目的基因与载体连接、感受态制备及转化【实验原理】1；酶促生物化学反应过程在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。2；DNA连接酶的分类：T4DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子3；T4DNA连接酶：来源T4噬菌体感染的大肠杆菌最佳pH值7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6的Tris-HCl缓冲液需ATP，Mg2+参加反应二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统真核细胞：主要用于外源基因的表达6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染：指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。7；感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。常用方法：0.1mol/LCaCl2特点：a.重组酶缺陷，限制修饰系统缺陷b.不存在载体的筛选标记c.接受DNA的位点暴露d.细胞膜通透性增加8；不同层次,不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。直接筛选：针对载体携带的标记和插入DNA片段1.抗性筛选（抗生素平板，ampR,tetR,neoR）2.标志补救（α-互补，蓝白斑筛选)3.PCR4.限制性内切酶消化4.DNA测序间接筛选：针对插入片段的蛋白产物，免疫学筛选9；蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。【实验数据】上图即为蓝白斑筛选的结果，其中白斑即为重组体，蓝斑为未重组质粒的菌。【实验分析】1；若菌落不明显，原因是保温箱温度过高，培养基蒸干。2；实验要注意无菌操作，所有步骤应在无菌区进行。3；蓝色菌落较少，白色菌落多且明显是因为DNA连接的比较成功。4；菌液涂抹均匀，菌落分布均匀。5；未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。