抗体类药物的质量控制—张伯彦-

Slide1张伯彦博士北京天广实生物技术股份有限公司抗体类药物的质量控制提纲目录单抗体类药物结构和变异体特征依赖临床周期的生产工艺和产品的质控体系生产用细胞株克隆筛选方法生产过程中控体系原液成品放行质量标准原液成品稳定性研究质控分析方法开发质控分析方法的有效性验证结构确证，表征分析和关键质量因素评估可比性评估（仿制药与原研药，工艺变更，场地变更）总结致谢2人IgG1裸抗体的结构Fab：抗原结合轻链轻链重链重链重链重链Fc：抗体和补体依赖的细胞毒作用药物代谢铰链区铰链区HindgeRegion罗氏/基因泰克公司KADCYLA模式（2013年2月）赖氨酸偶联西雅图基因公司ADCETRIS模式（2011年8月）目前针对多种癌症的大量临床研究的ADC使用这种模式。这种模式尚处于早期研发阶段（点突变的Thio-Mab或Ambrx的非天然氨基酸）。轻重链间二硫键偶联定点偶联抗体-毒素偶联物（ADC）抗体结构和其电荷变量产生的原因CH2CH3CLVLVHCH1CH2VLCLVHCH1CH2CH3C-端•LysVariants•Amidation链间二硫键位置•Glutathionylation•CysteinlyationFcRegion•Sialylation•Non-Glycosylation•Glycanvariations任何位置•Deamidation•Glycation•SuccinimidefromAsp变化视具体情况：•Fragmentation•Aggregation•Oxidation•Isomerization•Sequencevariant•Higherorderstructure酸性峰-Red碱性峰-Blue视具体情况-Green电荷变量是测定抗体药物降解变异最灵敏的一种方法。抗体类药物是产品相关杂质的混合物1.体积变异体–Terminologies:Aggregates,mainpeak,fragments–Assays:HPSEC,CE-SDS,SDS-PAGE,AUC2.电荷变异体：causedbyPTMs–Terminologies:Acidicpeak,mainpeak,andbasicpeakvariants–Assays:HPIEC,iCIEF,pH-IEC3.序列变异体:causedbyunintendedaminoacidsubstitutions–Terminologies:sequencepolymorphism;mutation;mis-incorporation;sequenceextension,insertion,deletion,andcrossover.–Assays:MultipleproteolysispeptidemappingmethodswithLC-UV-MS/MSdataanalysis4.高级结构变异体–Terminologies:highorderstructure(HOS);tertiarystructuralisomer.–Assays:HDX-MS,hydroxylradicaloxidationfoot-printing,otheremergingtechniques.6Page7CDR氨基酸修饰降解或序列变异的重大影响CDRs•可能降低结合亲和能力Decreasedbindingaffinity–例一，奥玛组单抗：WakankarAAetal.,“Aspartateisomerizationinthecomplementarity-determiningregionsoftwocloselyrelatedmonoclonalantibodies”,Biochemistry,2007,46(6)1534-44.–例二：VlasakJ.etal.,“IdentificationandcharacterizationofasparaginedeamidationinthelightchainCDR1ofahumanizedIgG1antibody”,Anal.Biochem.,2009,392(2)145-154.•可能改变结合特异性Alteredbindingspecificity–Possiblechangeinantigenspecificityand,ultimately,tissuespecificity–Highimpactbutlowprobability--thealteredspecificityisachievedonlywithagreatdealofengineeringandmultiplealterations•可能增加免疫原性Increasedimmunogenicity–Idiotypicmarkers–Epitopespreading:increasedimmunogenicityoftherapeuticpossiblyleadingtobroaderimmuneresponsetothetherapeuticantibodyPage8人源骨架区域修饰降解或序列变异的重大影响•可能增加免疫原性Increasedimmunogenicity–Allotypicmarkers*例如：JefferiesR.LefrancM-P.,Humanimmunoglobulinallotypes:Possibleimplicationsforimmunogenicity,mAbs,2009,1:332-8.–Epitopespreading:increasedimmunogenicityoftherapeuticpossiblyleadingtobroaderimmuneresponsetothetherapeuticantibody–Perhapssequencevariantsinconstantregionsshouldbeofgreaterconcernthanthoseinvariableregionsbecauseoftheirpotentialimmunogenicity•可能改变功能活性和药代药理–CH2区域：FcIIIRbindingaffinity,ADCC,CDCactivities–CH3区域：FcRnbindingaffinity,PKPD例如：Yeungetal,“EngineeringhumanIgG1affinitytohumanneonatalFcreceptor:impactofaffinityimprovementonpharmacokineticsinprimates”,JImmunol.2009,182(12):7663-71.例如：Houde,D.etal,,Post-translationalmodificationsdifferentiallyaffectIgG1conformationandreceptorbinding”,Mol.CellularProteomics,2010,9:1716-1728.提纲目录单抗体类药物结构和变异体特征依赖临床周期的生产工艺和产品的质控体系生产用细胞株克隆筛选方法生产过程中控体系原液，成品放行质量标准原液，成品稳定性研究质控分析方法开发质控分析方法的有效性验证结构确证，表征分析和关键质量因素评估可比性评估（仿制药与原研药，工艺变更，场地变更）总结致谢9Page10依赖临床周期的生产工艺开发（创新药）临床I期临床II期临床III期上市后III期临床样品生产工艺锁定临床前Registrationbatches工艺优化发生在I/II期间，III期临床前.预期工艺变更不容许工艺变更克隆筛选forPhIGMP生产克隆筛选forPhIIIGMPRegulatoryfilingwithUSAFDAINDINDaBLA美国基因泰克公司：创新生物药一般来说，一个创新抗体药从DNA质粒构建到BLA上市，需要8-10年时间。临床前到拿到临床批件约13到15个月。Page11依赖临床周期的生产工艺开发（仿制药）CDE审批临床I/II期临床III期上市后III期临床样品生产工艺锁定临床前Registrationbatches工艺优化发生在I/II期间，III期临床前.I/II期临床样品生产工艺确定不容许工艺变更克隆筛选forPhI/IIGMP生产临床申请临床三期计划生产批件中国生物制药公司：一般来说，一个仿制抗体药在我国从DNA质粒构建到拿到生产批件上市，目前也需要8年左右时间。临床前到拿到临床批件估计约3年到3年半。临床批件克隆筛选forPhIIIGMP生产为什么要做克隆筛选？Amidation(C-term)*Di-,tri-sulfidebondformationN,O-GlycosylationC-mannosylation(W)Proteolyticprocessing(C-term)SequenceVariantsOxidation(M,W,H,F,Y)S-CysteinylationDisulfidescramblingS-GlutathionylationThioetherformationReductionDeamidation(NG,NT,NS)Isomerization(DG,DS,DD)TransaminationGlycation(K)Hydrolysis(DP)1。影响抗体质量的蛋白表达后修饰细胞内细胞外都有发生；2。质控的目标是降低或避免在生产过程中不希望看到的PTM和序列变异发生的现象。13方法目的PhI克隆筛选PhIII克隆筛选CE-glycanassayN-glycosylationvariationsSECAggregationleveliCIEF成像毛细管凝胶电泳仪ChargeheterogeneityLC-MS轻重链还原分子量ID,PTMs1stLC-UV/MS/MSpeptidemap,tryptic胰酶肽图UVprofiling,MS/MSdataacquisition2ndLC-UVpeptidemap,chymotrypticorothersUVprofiling,MS/MSdataacquisitionTargetedMascot-ETSIdentifypossiblePTMforaMS/MSCompleteMascot-ETSsuggestallpossiblePTMs快速;Profilecomparisontolookfor“Change”全序列完全鉴定Completecharacterization克隆筛选分析方法选择14LC-MS测定抗体分子量也可以看出主要糖型分布50485(H+G0)50647(H+G1)50809(H+G2)49040(H)49168(H+K)Predictedmass(H):49039DaDeterminationerror:20ppm(∆1Da)去糖和还原的重链分子量142852(H2L2)142979(H2L2+K)去糖的完整蛋白分子量完整蛋白分子量145742(H2L2+2G0)145903(H2L2+G0+G1)146066(H2L2+2G1)146227(H2L2+G1+G2)还原的重链分子量Page15UV肽图对比方式可以发现高含量的序列变异体Time/minAbsorbanceat214nm0102030405040455055N13610411Time/minAbsorbanceat214nm0102030405040455055N13610411080160240320400480560640838485868788899091N2Time/minAbsorbanceat214nm3610411P2080160240320400480560640838485868788899091N2Time/minAbsorbanceat214nm3610411P2aYang,Y.,etal“Detec