漆酶活性测定方法

一、测O2法漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有Oz的介入。测量反应的耗氧量既可间接地推知漆酶的活性。较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一原理。这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将1个漆酶活性单位定义为PH6．o及25℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时消耗1.0μmolO2所需要的酶量。亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶的活性。郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量，同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律及漆酶促吸氧的克分子比。此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒[21。漆树酶活力检测用0..1mol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10mol·L-1。分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催化反应的初速度，单位记为△A350mm(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212漆酶活性的定量测定方法21211分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495)、愈创木酚(λmax485)、邻苯二酚(λmax400)和漆酚(λmax420)都可用做漆酶活力测定的底物。不同来源(植物、细菌、昆虫、真菌)的漆酶与底物反应的亲和力不同,酶活性测定方法中所用的反应底物、反应条件以及酶活性单位定义对漆酶活性的测定结果有很大的影响。肖亚中等分别以2,2′2连氮二(32乙基苯并噻唑262磺酸,简称ABTS)、丁香醛连氮愈创木酚和邻联甲苯胺为底物,采用分光光度法测定蜜环菌(Armillariamellea)胞外漆酶的活力,比较了这种底物对漆酶的敏感性,结果表明对于同一底物,反应时间、温度、缓冲液种类及其pH值和酶的用量等条件对漆酶催化反应都有不同程度的影响。邻联甲苯胺水溶性较差;愈创木酚为底物时反应非常稳定,但反应时间长、测得的漆酶活性值偏低,已较少采用;以丁香醛连氮为底物时,漆酶活性值虽然较高,但当底物和酶液用量较大时反应不稳定,若采取减少底物和酶液用量的方法,可较大程度地克服反应不易终止的缺陷。目前常以ABTS为底物,测定漆酶活性,反应稳定、重现性好。21212通过检测酶与底物中间体来测定漆酶活性在酶反应开始时产物生成量很少,而酶2底物中间体生成的速率较快。若采用初始速率法测定中间体的浓度,可间接测定漆酶活性,大大提高方法灵敏度。用微量热法测定漆酶的活性,样品用量少,并且对酶的悬浮液体也能测定,适宜研究酶促反应.黄应平等利用反相胶束介质中漆酶氧化邻苯二胺(OPDA反应中间体动态吸收光谱来测定漆酶活性。该方法由于在反相胶束介质中采用初始速率法进行测定,具有较高的灵敏度和选择性。已报道的定量测定漆酶活性的方法还有HPLC法、测氧法等。测氧法灵敏度低,操作繁琐;HPLC法灵敏度高,但仪器昂贵;酶催化光谱分析法应用较普遍,但一般是在水相中测定产物光谱信号变化,灵敏度较低。2漆酶的酶活测定方法测定漆酶活性的方法有HPLC法、测压法、分光光度法、级谱法等。目前常以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)为底物,测定酶对其的氧化速度。具体方法为:反应在25℃下进行,在总反应体积3mL中,含有2mL溶有0.5mmolABTS的0.1mmolL醋酸缓冲液(pH=5.0),添加酶液启动反应,在420nm下测定其吸光值的变化。酶的活力单位定义为在上述条件下(25℃,pH5.0)1mL酶液每分钟氧化底物(ABTS)引起吸光值的增加量(△OD420/(mL·min)).ClemmarJD等以二茂铁(Fc·H)作为底物,在二乙二醇单丁醚(DGBE)磷酸缓冲液中,用分光光度计在617nm处测定漆酶的活性1该法无副产物干扰,重复性好。望天志等采用微量热法测定了漆酶的活性1。对LKB-2107Batch型微量热系统,在温度为298.15K,pH为7.4的条件下,测定了漆酶的催化活性。该法的特点是用样品量少,并且对酶的悬浮液体也能测定,宜用于研究酶促反应。1.4分析方法：测定漆酶酶活方法测定漆酶酶活有以下5种方法，我们选用第一种方法来测定酶活。1.4.1ABTS——分光光度计法以ABTS为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。它有如下优点：(1)ABTS易溶于水，在室温下放置6个月仍较稳定。(2)其反应只有一步，即从ABTS到它的阳离子自由基。ABTS的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。(3)在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。(4)到目前为止，还未有报道称ABTS有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。WolfendenandWilson分别对5mmol/LABTS加入20μmol/L的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS呈浅蓝绿色，且在415nm处有吸收峰；而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415nm处无吸收峰。ABTS的最大吸收峰在340nm，ABTS的阳离子自由基的最大吸收峰在415nm.由此推断，在ABTS的溶液中含有极少的ABTS阳离子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS为底物进行漆酶的定量分析，通常在420nm下测定3min内吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即ABTS阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ABTS浓度的影响。这就产生了一个问题：420nm下的摩尔吸光系数36000L/(mol•cm)是在纯ABTS阳离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中，ABTS是过量的，这就导致人们低估了酶活。这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1mmol/L的ABTS。尽管用ABTS为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的最佳底物之一。一般以ABTS为底物，采用Glycine2HCl缓冲体系、乙酸2乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐2磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对ABTS的氧化。1.4.2丁香醛连氮——分光光度计法丁香醛连氮(Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为相应的醌，它的摩尔吸光系数为65000L/(mol•cm)。其摩尔吸光系数较大，可见用它定性测定漆酶的酶活具有较高的灵敏度。采用McIlvaine缓冲体系(pH=5.0)，在525nm处测定吸光度的增加。1.4.3二茂铁——分光光度计法以二茂铁(Fe2H)为底物的反应方程式：Fe2H+e2Cu2+e2Cu++[Fe2H]+e2Cu++4H++O2＝e2Cu2++2H2O-[Fe2H]溶于水，呈蓝色，在617nm处出现特征吸收峰，Fe2H不对其发生干扰。因此，以二茂铁为底物，用分光光度法测定漆酶活性准确度较高，重复性较好。由于二茂铁不溶于水，因此季立才等选亲水性和疏水性都较好的DGBE作溶剂，与0.1mol/L磷酸盐缓冲液以1∶5体积比混合后，使二茂铁以一定浓度溶解，同时保持漆酶活性。季立才等从生漆中分离、纯化漆树漆酶，并经CM2SephadexC50柱层析，得蓝色酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个组分，以二茂铁为底物，用DGBE2磷酸盐缓冲液(pH=8.0)，在617nm处测定吸光度的增加。该方法无副产物干扰，简便、准确、易行。但目前使用并不广泛，故用这种方法测定的酶活力的可比性不高。.还有其它一些用于漆酶酶活测定的底物，无论用哪一种底物进行测定，都有其自身的优势和不足。1.4.4微量热法望天志采用LKB22107Batch型微量热系统，在温度为298.15K，pH=7.4的条件下，测定了漆酶催化氧化底物3，4，5-三羟基苯甲酸、邻苯三酚、邻甲氧基酚的活性，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制成pH=7.4的缓冲液。该法操作简单，所用样品量少，不需要光学透明的样品，对酶的悬浮液也能直接测定，对反应体系没有任何限制或干扰。1.4.5脉冲激光光声法阎宏涛等首次采用脉冲激光光声法测定了漆酶酶活。试验了入射激光能量、激光照射时间和温度变化等因素对漆酶活性的影响；建立了测定漆酶的光声分析方法，检测限为3μg，是一种高灵敏度的生物样品分析方法。3.3.1ABTS法测酶活3.3.1.1主要试剂与仪器主要试剂：⑴1mmol/LABTS溶液，ABTS为美国Sig2ma公司产品，精确称取0.0274gABTS，用蒸馏水定容至100mL，置于棕色瓶备用；⑵Hac-NaAc（pH4.5）缓冲溶液，18gNaAc，9.8mlHAc，用蒸馏水定容至1L，用pH计校准其pH值。主要仪器：⑴UV-2100型紫外-可见分光光度计，UNICO尤尼柯（上海）仪器有限公司；⑵DELTA320型pH计，METTLERTOLEDO梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司。3.3.1.2漆酶最适pH值的测定方法在25℃时，以2mLBritton2Robinson缓冲溶液，外加1mL用蒸馏水稀释104倍的漆酶液为空白；先设定参数，使吸光度自动归零。取1mL相应pH值的Britton2Robinson缓冲溶液，用蒸馏水1mL稀释104倍的漆酶液，再加1mL的1mmol/LABTS溶液于比色皿启动反应，同时用UV-2201型紫外-可见分光光度计的TIME2COURSE程序记录吸光度在420nm波长处4min内的时间历程，取该曲线最初部分的斜率为酶反应的速度，酶反应速度最大时对应的pH值为漆酶的最适pH值。查文献知漆酶酶活最适pH为4.5。3.3.1.3漆酶稀释倍数及酶活力的测定方法取酶液0.1ml，加入Hac-NaAc（pH4.5）缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下吸光值。共读取6～7个数值。以经验判断，若吸光值增长迅速，则将酶液稀释2～5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均在0.2～0.8之间。酶活的计算：吸光度变化的斜率×4000×稀释倍数。2.2以丁香醛连氮为底物测定漆酶活力表2缓冲液对漆酶活力的影响Tab.2Effectofbufferonlaccaseactivity缓冲液LaccaseactivityöIU·L-113233酒石酸钠(pH3.0,ABTS∶酶为100∶30)1594536琥珀酸(pH4.5)167364831代表酶液取自静置培养36d的发酵液;332代表酶液取自静置培养19d的发酵液.2.2.1方法1用0.5mmolöL丁香醛连氮0.2mL和1.8mL酶液在1.5mL、50mmolöL的磷酸缓冲液(pH6.0)中反应,测定25℃下525nm处[4]吸光度的增量,并在不同的反应时间测定酶活力.在实验过程中发现,表3反应时间和反应条件对漆酶活力的影响Tab.3Effectsofreactiontimeandreactionconditiononlaccaseactivity反应时间ömin酶活力öIU·L-1(不冰浴)酶活力öIU·L-1(冰浴)536.6224.951023.7815.171515.4210.29吸光度不太稳定,因此采取冰浴和不冰浴两种终止反应的方式来探讨最适测定条件,比较结果见表3.表3结果表明以下规律:首先,随反应时间的延长酶活力逐渐下降.其次,不冰浴终止反应时测出的酶活力普遍比以冰浴终止反应时要高.在不冰浴条件下虽然酶活力较高,但测定过程中吸光度不太稳定,所以此方法有待改进.