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1漆酶的提取纯化及其脱色研究摘要【目的】本实验通过选取一株突变的高产漆酶的粗毛栓菌发酵液（培养11天产生漆酶酶活最高），经过离心沉淀过滤，硫酸铵沉淀，SephadexG-75凝胶过柱层析，分离纯化漆酶以及测定其纯化相关参数，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各步分离后的成分变化。最后研究其脱色的效果，为漆酶应用的相关研究提供实验依据。【方法】利用过滤，硫酸铵沉淀，SephadexG-75凝胶过柱层析，的方法提取纯化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离成分，并用光密度测漆酶的脱色率。【实验材料】发酵液，相关试剂【预计结果】选用凝胶浓度为12%，结果可以明显看出，经过纯化的漆酶的条带是单一的，相关参数（蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数）比较高，另外，脱色效果比较显著。【结论】关键词漆酶纯化脱色应用1前言1.1实验的研究意义木质素是植物中产生的一类难于降解的高分子化合物的统称，主要由苯丙烷单元通过醚键和碳键等多种共价键连接而成的杂聚物，是自然界中碳循环的限速环节之一。其降解主要由微生物完成，这类微生物主要包括真菌、放线菌和细菌。其中白腐真菌（whiterotfungi）被认为是生物圈中植物天然高分子物质木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，能使这些物质最终分解为二氧化碳和水。白腐真菌通常通过分泌木质素过氧化物酶（Ligninperoxidase，Lip）、锰过氧化物酶（Manganeseperoxidase，MnP）和漆酶（Laccase，Ec1.10.3.2）三种主要的木质素降解酶类来降解木质素。其中漆酶，能够将木质素降解为CO2和H2O，反应过程不需要H2O2的参与，在木质素降解中起主要作用。其中漆酶（Laccase）是一种多酚氧化酶（p-diphenoloxidaseEC.1.10.3.2），属于蓝色氧化酶家族。漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质2能源等领域具有广阔的应用前景，利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用，进行合理的开发利用，可减少化学药品的使用量，降低生产成本和保护环境。本实验通过过滤，硫酸铵沉淀，凝胶层析柱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法提取纯化漆酶,结果蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数都取得较好的效果，对于漆酶的分离、提纯及其天然结构和生理功能的研究中有重要的作用。漆酶的脱色实验很好的证明了漆酶的重要用途，为漆酶的实用性，工业用途提供了实验平台。1.2实验的创新性在以往的漆酶的提取纯化过程中，要做到蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数同时较高是比较困难的，尤其是最后得到的漆酶不仅酶量少，而且酶活较低。在本实验中，我们经过多步骤纯化，并注意保持其酶活，最后得到的漆酶酶活高，纯度高。目前，我们从所查阅的大量参考文献中可知，漆酶的脱色反应操作比较困难，主要原因为无法提取纯度较高的酶，或者最后得到的漆酶酶活太低，导致脱色效果不明显。因此，漆酶的脱色反应一直没有被广泛应用。我们设计这个实验以纯化提取为基础，具有可行性强、操作简单、方便等特点。为漆酶的脱色应用的研究提供一个参考实验。2实验目的（1）得出一种能分离，纯化漆酶并保持较高酶活的方法。（2）完成漆酶的一个重要的应用—脱色反应，为漆酶的实际应用提供实验研究基础。3实验原理3.1硫酸铵沉淀法蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水集团与水形成水化膜的成都以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当有中性盐加入蛋白质溶液时，中性3盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。【*】3.2SephadexG-75凝胶过柱层析凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，小分子物质能进入其内部，流出速度慢，而大分子物质却被排除在外部，流出速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子大小筛分开。根据查阅相关文献，粗毛栓菌主要漆酶的表观分子量为61.5KD【*】，因此，本试验采用SephadexG-75（葡聚糖凝胶G-75）填料，孔径相对分子量范围2kD~70kD。3.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳是以丙烯酰胺为单体，N，N’-甲叉丙烯酰胺为交联剂，在催化剂（过硫酸铵）和引发剂（TEMED）的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构。这种网状结构具有分子筛效应，分离分子通过网孔的能力取决于凝胶孔大小和形状，也取决于被分离分子的形状及大小，但在SDS-聚丙烯酰胺电泳中，蛋白质与SDS形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，而且，其还引起了蛋白质构象的改变，使蛋白质的电泳迁移率只与其质量有关，因此可以测定蛋白质的相对分子质量及分离提纯蛋白质。【*】3.4A280测定蛋白浓度蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。43.5漆酶活性测定漆酶（Laccases,EC1.10.3.2）活力的测定，参照文献【*】，采用ABTS[2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid）]法。反应体系含有1.95ml0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液（pH4.0）、2.00ml0.5mmol/L连氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液和经适当稀释的酶液50uL，于28℃启动反应并连续测定反应液在3min内于420nm（ε=3.6×104cm-1mol-1L）处吸光值的增加值。定义该条件下，每分钟使1umol/LABTS转化所需的酶量定为1个活力单位（U）。漆酶活力计算公式如下：漆酶活力（U/L）=n×△A×106×V总/=3.6×104×3×V酶式中：n为酶液稀释倍数V总为反应总体积V酶为反应酶液体积△A为反应液在3min内在420nm处吸光值的变化值3为反应时间（min）3.6×104为ABTS氧化态的摩尔吸光系数（cm-1mol-1L）3.6漆酶的脱色测定由于漆酶具有单电子氧化还原电位高、催化活性强等特点,可以氧化芳香环化合物,对染料的脱色及降解效果明显。在紫外可见分光光度计上可得到不同的吸光值，用于比较其脱色效果。4实验设备表1实验设备名称规格数目备注冰箱----1台4℃电热恒温水浴锅----1台电子天平----1台电子分析天平----1台紫外分光光度计----1台5恒流泵----1台微量加样器50μL1支凝胶成像系统----1套大型冷冻离心机1台自动部分收集器----1台配套30支小试管玻璃层析柱柱长28cm、柱直径1.5cm1支移液枪5mL、1mL、200μL各1支配套枪头稳压稳流电泳仪----1台水平振荡器----1量筒50mL、200ml、500mL、1L各一个烧杯50mL、100mL、500mL夹心式垂直板电泳仪各品牌皆可1台玻璃板、0.1cm薄胶条、夹子、0.1cm梳子、导线吸管----试剂瓶剪刀----玻璃棒----3支试管10ml20个配套试管架：2个胶塞锥形瓶玻璃管乳胶管-----1米6圆底烧瓶1L1个接液管------1个铁架台------1个含有夹子等酸式滴定管------1支50mL标签纸-------若干广泛pH试纸----一包保鲜膜----1卷纸卷----1卷5实验材料及试剂5.1实验材料5.1.1由华南农业大学生物技术研究所提供高产漆酶粗毛栓菌发酵粗酶液5.2实验试剂表2实验试剂试剂名称规格丙烯酰胺（Acr）分析纯甲叉双丙烯酰胺（Bis）分析纯浓盐酸分析纯氯化钠分析纯磷酸二氢钠分析纯磷酸氢二钠分析纯过硫酸铵（AP）生化试剂四甲基乙二胺（TEMED）生化试剂标准蛋白Marker14.4-90KDa生化试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）生化试剂SDS分析纯甘氨酸生化试剂7甘油分析纯二硫代苏糖醇（DTT）分析纯β-巯基乙醇分析纯冰乙酸----硫酸铵分析纯考马斯亮蓝R-250分析纯考马斯亮蓝G-250分析纯甲醇----无水氯化钙----葡聚糖凝胶G-75----凡士林----溴酚蓝分析纯硼酸分析纯甲基红分析纯溴甲酚氯或次甲基蓝分析纯氧化镁-----碳酸钠分析纯无水乙醇分析纯氢氧化钠分析纯PEG20000分析纯5.3硫酸铵沉淀相关试剂配备PBS溶液（pH6.8）：取490ml0.2mol/LNa2HPO4,510ml0.2mol/LNaH2PO4混合后定容至1L。5.4SephadexG-75凝胶准备及相关试剂配制5.4.1SephadexG-75凝胶准备1.从厂家提供的溶胀系数和需要的装柱的大约柱床体积计算需要的凝胶干粉的量。将计算量的凝胶干粉加入到两倍的计算凝胶终体积的凝胶过滤脱盐缓冲8液中。2.用玻璃棒小心搅拌悬液，让凝胶室温条件下溶胀过夜，或90℃水浴3h，适时搅拌保持凝胶呈悬浮状。3.让凝胶沉淀，轻轻倒出雾状溶液以除去细小和破碎的凝胶颗粒。重复这一步骤，直到凝胶沉淀床清晰可见，然后将其稀释，使凝胶沉淀床和凝胶过滤缓冲液体积比为1：1。5.4.2相关试剂配制1.洗脱缓冲液（pH7.50.05mol/LTris-HCl溶液）：50mL0.1mol/LTris溶液与40.3mL0.1mol/L盐酸混匀后，加蒸馏水定容至100mL。5.5SDS-PAGE电泳凝胶相关试剂的配制1.30%丙烯酰胺凝胶贮备液：取30g丙烯酰胺（Acr）和0.8g双丙烯酰胺（Bis）冗余蒸馏水中，定容至100mL，过滤后4℃下贮存备用。2.10%过硫酸铵（AP）溶液：称取0.10g过硫酸铵溶解于1ml蒸馏水中，现配现用。3.10%四甲基乙二胺（TEMED）：取0.20g四甲基乙二胺（TEMED），加蒸馏水溶解，定容至2mL。4.分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8）：取18.15gTris（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加1mol/LHCl溶液约48mL，调pH至8.8定容至100mL。5.浓缩胶缓冲溶液（0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8）：取3.00gTris（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加加1mol/LHCl溶液约20mL，调pH至6.8定容至50mL。6.10%SDS溶液：取5gSDS加蒸馏水溶解并定容至50ml。7.样品缓冲液（0.1%SDS-1%巯基乙醇-或20%甘油-0.02%溴酚蓝-0.2%SDS）：取0.05gSDS、0.5mlβ巯基乙醇、10ml甘油、0.1mL0.5%溴酚蓝、1mL10%SDS溶液，用蒸馏水定容至50mL。8.电极缓冲液（0.1%SDS-0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3）：取Tris、甘氨酸和SDS加水溶解后，调pH值至8.3，定容至1000mL。9.染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇溶液-10%冰乙酸溶液）：取0.1g考马9斯亮蓝R-250，加入45mL甲醇溶液、10mL冰乙酸，用蒸馏水定容至100mL。10.脱色液（7.5%冰乙酸-5%甲醇溶液）：取75mL冰乙酸、50mL甲醇溶液，加蒸馏水定容至1000mL。11.指示剂（0.5%溴酚蓝溶液）：去0.25g溴酚蓝，加蒸馏水溶解，定容至50mL。5.4材料的处理5.4.1发酵液的处理用最佳培养基发酵高产漆酶粗毛栓菌，培养11天停止发酵，10000rad/min离心10分钟，取上清液，抽滤除去菌丝体等杂质，得到发酵液，置于4℃冰箱保存。6实验操作步骤6.1硫酸铵分级盐析分离粗酶（因所需时间较长，所以在正式实验前完成）（1）在100mL发酵液中缓慢加入硫酸铵粉末，并温