MolecularDiagnosisYuanMingWu2011.521978年,美国科学院院士美籍华裔科学家YWKan(简悦威)和Dozy应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症的基因诊断,标志着检验诊断进入基因诊断时代。3分子诊断的概念和特点分子诊断的基本技术分子诊断的医学应用一、基因诊断的概念和特点(一)定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术,对生物体的DNA、RNA、蛋白质及代谢分子进行定性或定量分析,从而对疾病作出诊断的方法。称为分子诊断。分子诊断的分类:DNA诊断----检测相关基因的结构及其表达功能是否正常。RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表达的分析。蛋白质诊断----对编码蛋白质的质和量表达的分析。代谢物诊断----对生化代谢产物等小分子物质的分析。基因诊断(二)特点1.遗传性疾病2.感染性疾病3.肿瘤4.法医学的应用5.组织病理学特异性强灵敏度高应用性广早期诊断(三)基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别表型诊断(传统方法)基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常分类临床诊断血清学诊断生化学诊断DNA诊断RNA诊断特异性表型改变在很多情况下是非特异性的,往往难以明确诊断,延误病情以探测基因为目标,只要有特异性探针,利用分子杂交原理即可诊断,具有很高的特异性敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高,标本只需微量,DNApg水平即可早期诊断因为表型改变往往出现较晚,难以早期诊断在表型改变之前,基因结构或表达已发生改变,故往往可以早期诊断核酸分子杂交技术核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用杂交信号检测分子杂交样本抽提DNARNAcDNA反转录合成寡核苷酸引物制备和标记探针PCR扩增分子诊断的基本技术流程(一)、核酸分子杂交原理:核酸的变性复性理论。双链的核酸分子在某些理化因素(如高温等)作用下,双链解开,待条件恢复时,又按碱基互补配对规律形成双链结构。在这一过程中,不同来源的DNA(RNA)分子,只要具有部分互补配对的碱基序列,即可形成杂合双链。复性*核酸分子杂交的分类:1.杂交发生的环境:固相杂交:样品位于固相支持物上,与液相中的探针杂交液相杂交:样品和探针在液相中杂交。2.杂交样品的位置:核酸印迹杂交:SouthernBlot,NorthernBlot斑点杂交(dotblotting)或狭缝杂交原位杂交(insituhybridization)基因芯片(一)核酸印迹杂交一般步骤:1.探针的制备(标记)2.样品的制备3.电泳分离4.转膜5.杂交:预杂交——杂交6.结果检测1.探针的制备(标记)探针(probe)——用放射性核素或其他标记物标记的短的核酸片段(几十至几百核苷酸),它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段互补结合,因此可以用以检测核酸样品中的特定DNA或RNA。种类:DNA,RNA,寡核苷酸标记物:放射性核素(同位素):32P,3H,35S生物素,地高辛,荧光素[如异硫氰酸荧光素(FITC)等]制备方法:(1)化学法:标记物分子活性基团与核酸分子上的基团发生化学反应;(2)酶促法:标记核苷酸(原料中的一种dNTP),酶促合成探针。酶促法最为常见:•不同种类的探针:(1)DNA探针标记:T4DNA聚合酶,T4多核苷酸激酶等(2)RNA探针标记:相应基因克隆入载体,体外转录过程中被标记。(3)cDNA探针标记:反转录过程中被标记。•不同标记范围:(1)末端标记:如T4多核苷酸激酶对探针进行5’末端标记;(2)整链标记:切口平移法,随机引物法等2.样品的制备:组织中提取:基因组DNA用特定的限制性内切酶消化细胞总RNA基因文库核酸混合物3.电泳分离:待测样品按照分子量大小分离,分子量markerDNA、RNA:琼脂糖凝胶电泳RNA、蛋白质等:聚丙烯酰胺凝胶电泳4.转膜印迹(印渍)技术:将存在于凝胶中的生物大分子转移到固定化介质上并加以分析的技术。用于DNA、RNA、蛋白质的检测。硝酸纤维素膜(NC膜)、尼龙膜、PVDF膜等(1)DNA印迹技术:SouthernBlotting(2)RNA印迹技术:NorthernBlotting,主要用于检测组织细胞中特定基因的表达(mRNA的存在)(3)蛋白质印迹技术:WesternBlotting毛细管转移法,电转移法等5.杂交预杂交:封闭样品中非特异性的结合位点。鲑精DNA,脱脂奶粉等杂交:将探针溶于杂交缓冲液,膜浸于其中进行杂交洗膜:缓冲液洗涤去除未杂交的探针。6.结果检测同位素:放射自显影荧光、化学发光:压X光片生物素等:酶标亲和素——底物显色(ABC法)地高辛:酶标抗体——底物显色(AP等)Southernblot用于基因组基因的定性定量、基因突变和特定条件下获得的基因片段(酶切片段等)的分析。注意事项:DNA样品的酶切,大片段脱嘌呤降解,电泳胶的处理(变性液),膜上DNA的固定(干烤或紫外交联)Northernblot用于特定基因表达的定性定量分析注意事项:(1)去除RNA酶。玻璃器皿:烘烤、氯仿冲洗、DEPC水浸泡;溶液:DEPC水处理;(2)制备凝胶:含有甲醛等变性剂。MOPS+甲醛。(3)样品的处理(变性):甲酰胺或甲醛(4)RNA电泳:18S和28SrRNA作为参照(5)RNA的转移:NaOH浸泡和DEPC水冲洗去除甲醛。OverexpressionofsisandmycmRNAinCO8.TwomicrogramsofpolyA+(sisprobe)and20µgoftotalRNA(mycandcdk4probes)fromeachcelllinewereanalyzedbynorthernblotting.三种印迹技术的比较NorthernblotWesternblotSouthernblot(二)斑点杂交(dotblotting)与狭缝杂交用于特定基因表达的定性定量分析将RNA或DNA变性后直接点样于膜上,再采用特定的探针进行杂交。Fig.2.NorthernblotanddotblotanalysesofSPRR3innormalepithelia(N)andmatchedtumourtissues(T).Ethidiumbromide-stainedtotalRNAandß-actinhybridizationareshownasloadingcontrolforthenorthernblotanddotblot,respectively.Figure1.DifferentialexpressionofBREmRNAinvarioushumantissuesusingthedot-blottinghybridizationassay.BREexpressionwasanalyzedinadot-blotmembranefilterfromClontechusinglabeledBRE-cDNAprobeasdescribedinMaterialsandMethods.(A)ThenamesandpositionsofthetissuemRNAspottedonthemembrane.(B)Hybridizationresults.(三)原位杂交(insituhybridization):菌落原位杂交:菌落从琼脂板复印到NC膜,裂解菌落,核酸固定,杂交。用于基因克隆和基因文库的筛选真核细胞核酸原位杂交:细胞,组织切片确定特定核酸序列在染色体上的定位;组织细胞中特定基因的表达水平(即相应mRNA的水平)Fig.1.Recentadvancesininsituhybridization(ISH)forthepast15yearsa:DetectionofribosomalRNAgene(rDNA)locuswithradioactiveribosomalRNA.b:DetectionofrDNAbyanon-RIlabelingmethod.c:DetectionofrDNAlociinIndicaricebyFISH.d:Detectionofmulti-colorfluorescencefromdifferentprobes(telomere,greenandTrsA,red)simultaneously.等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)如果基因的某一位点发生了突变,那么根据已知基因突变位点的核苷酸序列,设计并合成两种寡核苷酸探针,一种与突变基因的碱基序列互补(M),另一种与正常基因在相应位点上的核苷酸序列互补(N),通过杂交即可确定待检的2个等位基因是否有一个或全部发生了突变。核酸分子杂交技术核酸扩增技术DNA序列测定技术单核苷酸多态性检测技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学在分子诊断中的作用(二)、PCR——聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)按照DNA半保留复制的原理,在体外进行连续反应,呈几何倍数扩增特定DNA分子的过程。DNA模板合成原料:dNTP引物:一对高温DNA聚合酶:Taq酶缓冲液:含Mg2+H2O补充体积1.反应体系:2.反应过程:20-35个循环,每个循环包括:变性:95℃10-45s退火:55-65℃10-30s延伸:72℃30-60s循环之外:预变性:95℃3—5min;继续延伸72℃7min;回到室温。3’5‘5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’3’2n3’5‘5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’PCR的衍生类型:1.反转录PCR2.原位PCR3.重组PCR4.不对称PCR5.多重PCR6.反向PCR7.锚定PCR8.巢式PCRPCRPCR3.PCR引物设计:(1)长度:16—40bp,尤以18—24bp为最佳(2)末端:5’末端可与模板不互补,3’末端必须互补,3’末端最好不为A(3)序列:GC含量40%—75%,Tm值在56—62℃为最佳特异性避免引物二级结构4.PCR促进剂:甘油(10—15%)、DMSO(5%)、甲酰胺(5%)等。*反转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR):用于克隆已知基因或检测基因表达情况。1.培养表达目的基因的细胞,或分离表达目的基因的组织;2.提取细胞总RNA;3.反转录成cDNA;4.以cDNA为模板,设计引物进行PCR:(1)上游引物:5’—ttgaattcatgacaccacctgaacgtctcttc—3’(2)下游引物:5’—ttggatccctacagagcgaaggctccaaagaa—3’5.琼脂糖凝胶电泳观察目的基因条带;6.胶回收,酶切,克隆入载体。TNF-βmRNA:(618nucleotides)atgacaccacctgaacgtctcttcctcccaagggtgtgtggcaccaccctacacctcctccttctggggctgctgctggttctgctgcctggggcccaggggctccctggtgttggcctcacaccttcagctgcccagactgcccgtcagcaccccaagatgcatcttgcccacagcaccctcaaacctgctgctcacctcattggagaccccagcaagcagaactcactgctctggagagcaaacacggaccgtgccttcctccaggatggtttctccttgagcaacaattctctcctggtccccaccagtggcatctacttcgtctactcccaggtggtcttctctgggaaagcctactctcccaaggccacctcctccccactctacctggcccatgaggtccagctcttctcctcc