基因诊断3

1第10章基因诊断GenediagnosisChinaMedicalUniversityDepartmentofMedicalGeneticsp4802本章内容提示基因诊断概念基因诊断方法直接诊断（Southern）间接诊断（PCR-RFLP）DNA多态基因诊断实例：3第一节基因诊断技术第二节基因诊断方法及实例4基因诊断：利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。传统的诊断：表现型→基因型基因诊断：基因型→表现型（逆向诊断）5基因诊断的特征：1不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3产前诊断避免患儿出生，提高人口质量6第一节基因诊断技术Southern印迹杂交7基因诊断技术Northern印迹杂交8基因诊断技术斑点杂交点样Probe-32P检测AB12349基因诊断技术荧光原位杂交10基因诊断技术荧光原位杂交11基因诊断技术聚合酶链反应12基因诊断技术聚合酶链反应13基因诊断技术☆多重PCR在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失E1E2E314基因诊断技术☆RT-PCR以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度15基因诊断技术☆PCR-SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。16基因诊断技术---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳↓12345自显影↓1为正常结果分析2、4、5为纯合患者3为杂合子.17基因诊断技术生物芯片18第二节基因诊断方法及实例直接诊断——直接检测致病基因的突变基因突变类型——缺失、点突变、重复、插入等间接诊断——应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断DNA多态——RFLP、VNTR、SNP19一DNA多态DNA多态（DNAPolymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。20DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。21一)限制性片段长度多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称RFLPRFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。22AlleleII产生了新的酶切点AlleleIAlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8KbRFLP—Southernblot检测结果23AlleleII酶切位点消失24二)数目变异串联重复，variablenumbertandemrepeats,VNTR）重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR。散在分布于染色体上。重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。重复单位2~6bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。25VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）26VNTR酶切，电泳后的检测结果大小27PCR-VNTR检测28PCR-VNTR2930三)单核苷酸多态性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为：基因编码区SNP基因周边SNP基因间SNP在人类基因组中每100~300个核苷酸就有一个SNP31二、基诊断方法及实例直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern杂交，或通过PCR扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。直接基因诊断及实例32直接基因诊断—突变型遗传病的直接基因诊断e.g.镰形细胞贫血的Gene诊断331）Southernblotβ珠蛋白链基因第6位密码子发生突变GAG——GTG谷Aa——缬Aae.g.镰形细胞贫血的Gene诊断34已知限制酶Mst1识别序列（CCTNAGG）CCTGAGGCCTGTGG突变后不能识别，酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。352)ASO探针诊断已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。NormalβΑGeneProbe——与正常ProbeβΑ杂交稳定MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交稳定36等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）37斑点杂交结果：βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS正常探针突变探针突变型遗传病的直接基因诊断38突变型遗传病的直接基因诊断39BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe1）地中海贫血的基因诊断基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。直接基因诊断—缺失型遗传病的直接基因诊断40Southernblot检测结果：αα/αααα/α-αα/--α-/----/--正常缺1缺2缺3缺414kb10kb缺失型遗传病的直接基因诊断412）β地贫的Gene诊断β珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点，pst1酶切正常可得到4.4kb片段β珠蛋白基因缺失0.7kb片段，pst1酶切则得到3.7kb片段为β0缺失型遗传病的直接基因诊断42以βGene为探针，Southernblot方法检测βΑ/βAβΑ/β0β0/β04.4kb3.7kb缺失型遗传病的直接基因诊断433）DMD的基因诊断DMD属XRDMD基因是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位E1E2E3缺失型遗传病的直接基因诊断44病例外显子12345678Pm34350136476052bp535113缺失型遗传病的直接基因诊断45二）间接基因诊断方法及实例当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。46连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。遗传标记是基因组中的DNA多态如：RFLP，VNTR等。间接基因诊断47遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断481Southernblot--RFLP诊断(PKU)PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断49患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断502成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过ＲＦＬＰ连锁分析进行诊断。间接基因诊断51以3`HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行SouthernBlot基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊断5212123455.7kb3.4kb2.3kb间接基因诊断53结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断543甲型血友病诊断（PCR—RFLP）甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。PCR142bpBcLI142bp99bp43bp电泳结果分析p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+间接基因诊断55间接基因诊断56142bp99bp12123ⅠⅡIII1间接基因诊断57结果分析1）先症者II1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）间接基因诊断58单体型分析有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个基因探针杂交分析。根据同一条染色体上限制性位点的丢失或获得而出现的一组多态位点所构成的不同片段长度的组合类型进行分析，该分析方法称单体型分析（Haplotyping)间接基因诊断59举例：PKU家系HindⅢ酶切：患儿4.2/4.0kb杂合体父母4.2/4.0kb杂合体均为杂合体，无法分析。再用sphⅠ酶切：患儿纯合7.0kb父亲纯合7.0kb母亲9.7kb和7.0kb杂合体间接基因诊断60结果121234.2kb4.0kb11kb9.7kb7.0kbIIIHindⅢSphⅠ间接基因诊断61分析：患儿Ⅱ1从母亲和父亲各获得一个7.0kb突变型从HindⅢ酶切结果看出：正常同胞Ⅱ3为纯合4.0kb，也是sphⅠ7.0kb纯合体，故母亲H4.0kbS7.0kb构成单体型，母亲7.0kb为突变型，因此，母亲H4.0kbS7.0kb为突变单体型。间接基因诊断62患儿Ⅱ1为HindⅢ4.2/4.0kb杂合体，故父亲H4.2kbS7.0kb为突变单体型母亲H4.2kbS9.7kb和父亲H4.0kbS7.0kb为正常单体型。Ⅱ2两个单体型分别为H4.2kbS9.7kb（母）和H4.0kbS7.0kb（父）正常个体Ⅱ3两个单体型分别为H4.0kbS7.0kb（母）和H4.0kbS7.0kb（父）携带者间接基因诊断63基因诊断意义现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生