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PlatformTechnologiesofBiology生物技术平台的两根支柱：细胞培养技术&单克隆抗体技术细胞培养技术林旭瑷副教授医学院病原生物学系林旭瑷：办公室:医学院科研C817电话:88208294实验室:科研C804～810E-mail:lxai122@163.com关于考试：开卷，实验课结束前上交（10.26-10.27）（A4纸张打印试题，手写答案附后）10+40+50参考书谷鸿喜，张凤民，凌虹.细胞培养技术.北京大学医学出版社，2012章静波.组织和细胞培养技术.人民卫生出版社，2011谭玉珍.实用细胞培养技术.高等教育出版社，2010一、绪论二、细胞培养基础知识培养前准备/培养基/培养设备三、细胞培养基本技术培养技术/培养物的固定、染色/显微镜观察四、细胞培养中的细节问题内容组织培养的诞生与发展简史组织培养的优缺点组织培养常用术语组织培养的实际意义细胞系或细胞株的命名绪论细胞培养(cellculture)从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。细胞培养、组织培养和器官培养将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程。B、组织培养将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术。A、细胞培养C、器官培养是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1878ClaudeBernard:证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。1885WilhelmRoux:在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。1907RossHarrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从而解决了神经纤维的来源问题。RossHarrison被人称为细胞培养之父。1910Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞。1911Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。1916Rous&Jones:开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞。1923-1931Carrel:研制T型培养瓶大规模培养细胞。1927Carrel&Rivera:制造了第一个病毒疫苗——牛痘疫苗。1933Gey:发明了转管培养细胞的技术。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1948Fisher:研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。1952Gey和同事:分离培养了HeLa细胞。1952Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。1954Abercrombie:观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。1961Hatflick&Moorhead:发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。1965Ham:配制了第一个无血清培养液。1975KÖhler&Milstein:成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1.研究的对象是活细胞能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等二、细胞培养的优点2.研究条件可以人为控制选择对象：均一性、重复性（类型/性质/阶段）调节条件：化学、物理、生物等因素条件研究方法：各种研究技术、记录方法3.研究的范围比较广泛学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类一种动物：不同年龄--不同组织：正常或异常（肿瘤--）二、细胞培养的优点4.研究的费用相对较经济可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。1.与体内主要不同相对孤立、单一缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不明显,细胞趋向单一化二、细胞培养的缺点对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。提示三、常用术语•初代培养/原代培养（primaryculture）从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。初代培养物一旦进行传代培养后，就成为细胞系。通常10代以内的培养物用作原代培养。--有限细胞系（finitecellline）生存期有限的细胞系，不能继续传代或传代数有限。--连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，能连续传代。•传代培养（sub-culture）不论是否稀释，在体外培养条件下，将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿。•贴壁培养（anchorage-dependentculture）细胞或培养物只有贴附于不起化学作用的物体（玻璃或塑料等无活性物体）的表面时才能生长、生存或维持功能。不能表明细胞属于正常或恶性转化•悬浮培养（suspensionculture）细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。淋巴细胞、血液肿瘤细胞等•细胞株（cellstrain）通过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞。这些特性（有一定的标记染色体、特殊的抗原性等）在以后的培养中必须持续存在。--有限细胞株（finitecellline）生存期有限的细胞株。不能继续传代或传代数有限--连续细胞株或无限细胞株（infinitecellline）已获无限繁殖能力能持续生存的细胞株。能连续传代。•亚株（substrain）由原细胞株进一步分离培养出与原株性状有一定不同的细胞群二倍体细胞系或株细胞群染色体数目具有与原供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％以上）的细胞群。在正常情况下具有限生命期，属有限细胞系。随供体年龄和组织来源的不同，寿命长短各异。---人胚肺成纤维细胞可传40-60代---人胚肾细胞只有8-10代---人胚神经胶质细胞15-30代为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2-5代即大量冻存作为原种（stockcells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。假二倍体：仅数目相同，而核型不同，即染色体形态有改变者。遗传缺陷细胞系或株从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺陷细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。肿瘤细胞系或株是现有细胞系或细胞株中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。•细胞凋亡（apoptosis）细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程。与机体正常发育、形态形成、消除多余细胞等生理过程密切相关。主要形态特征为细胞皱缩、染色质聚集与周边化，以及凋亡小体的形成。•ATCC（Americantypeculturecollection）美国模式培养物收集中心/美国菌种保藏中心。除收集细菌、病毒外，还保藏有大量的细胞株（系）。•体外转化（invitrotransformation）细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的可遗传的变化，但不具有致瘤性。•汇合（confluence）在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层。•细胞融合（cellfusion）在体外培养条件下，经化学试剂（PEG）、病毒（灭活仙台病毒）或物理方法（电脉冲）诱发，使不同种的体细胞融合产生杂交细胞。•细胞周期（cellcycle）细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期（G1期）、DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期（G2期）。•群体倍增时间（populationdoublingtime）在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需的时间。•细胞代时（cellgenerationtime）单个细胞两次连续分裂的时间间隔。•群体密度（populationdensity）培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数，多用细胞数/cm2表示。•接触抑制（contactinhibition）当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时，便停止了分裂增殖，虽然相互紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入S期。•饱和密度（saturationdensity）在特定条件下，培养皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖，贴壁培养：细胞数/cm2；悬浮培养：细胞数/cm3。四、细胞培养的现实意义单克隆抗体制备过程多莉克隆猴对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌)CHO：中国地鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary)宫—743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3；美国国立卫生研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天传代一次，每次接种3×106cell/ml。五、细胞系或细胞株的命名已建立细胞系或株的签定、管理和使用培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻存液：培养基和防冻液名称。细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。培养液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血清来源和含量。ATCC（Americantypeculturecollection）入库细胞要求检测项目如下：已建立细胞系或株的签定、管理和使用细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无。无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。物种检测：检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。免疫检测：一两种血清学检测。细胞建立者：建立者性名；检测者姓名。有标准化的工作方法培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。细胞培养的工作原则