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近期有时间查一下RAW264.7这个细胞的资料和培养的注意事项，以及使用LPS诱导这个细胞产生NO，用于药物抗炎效果分析的相关实验步骤和注意事项一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。铁壁特别牢固。2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老花掉。二、培养中的注意事项及传代步骤1、培养之前，一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。（200-250℃烘烤4-6h）2、这种细胞的贴壁特别牢，每次传代都很难消化下料，下面是收集的一些消化及传代方法：方法一、消化液：0.5%胰酶、0.2EDTA，实验前加温到37℃以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底的80%时，弃去培养液，加D-HANKS漂洗两次；加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml，消化37℃约2-5min，镜下可看见细胞基本圆形即种植消化，弃去消化液加D-HANKS漂洗两次；3、加入新培养液10Ml反复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶中RAW264.7.4、如37℃CO2培养箱，几小时后即可贴壁。方法二、实验前将DPBS及DMEM加温到37℃，使用Flask75培养瓶；1、细胞贴壁生长，长满瓶底70%时，弃去培养液，加入DPBS10ml漂洗以质量次；加入10mlDPBS，然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS。用DMEM培养瓶10ml反复吹打混悬细胞；3、分入新的培养瓶；4、入37℃5%CO2培养箱，几小时即可贴壁。方法三：1）将培养瓶内旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两次，（一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用）2）加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml，37℃消化65min。镜下看到细胞变圆，间隙增大。3）立即加含有10%FCS的培养液终止消化，用细胞刀轻刮，注意，这时候用吸管吹下来，但是刮刀很容易刮下来，而且对细胞的伤害极小。4）离心，弃上清，加新的培养液（10%FCS），小心吹匀，分装入新的培养瓶。三、冻存的注意事项：1、RAW264.7的冻存过程应尽量减少热源对细胞的影响，这样对细胞种子的洁净度有更好的保障。2、这种细胞对空间状态很敏感，所以复苏的细胞密度应始终，如果密度过大复苏时细胞增殖太快，过密的生长会加剧细胞的营养缺乏，促使细胞老化。一般接种或复苏细胞数量控制在104-105为宜，这种接种密度接种在75cm2药瓶培养2天后细胞密度即可到达70-80%，状态好的话就可以进行后续的实验。