QPCR技术细节解析

程涛中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律PCR产物的积累规律示意图荧光定量PCR定量原理扩增曲线荧光定量PCR定量原理为什么终点定量不准确呢？荧光定量PCR定量原理尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cyclethreshold）与模板起始浓度有密切联系。Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值荧光定量PCR原理－－荧光阈值定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认NoTemplateControl(NTC)确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.135Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（r2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线对DNA模板没有选择性使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点容易产生假阳性对引物特异性要求较高不能进行多重定量缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立3’淬灭基团淬灭基团性质建议使用的5’报告基团TAMRA荧光物质FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非荧光物质FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探针法——荧光标记物的选择高度特异性重复性好可进行多重定量优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点不同定量方法的比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带不能进行多重定量适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好多重定量价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器软件RT上机反应体系优化试剂选择分析方法样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的RNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：55－60℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：50－150bp引物位置反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析反应体积＞5ul，推荐20－50ulMg2＋调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90％－110％重复性：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求误差控制上机试剂选择RT样品制备模板准备数据分析自配DBIRealmastermixRoche-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法实验流程及注意事项45oC55oC65oC溶解曲线扩增曲线1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,readevery0.2oC,hold1sec.Real-timePCR体系优化误差分析及操作规范同一cDNA样品的三个重复误差分析及操作规范如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。1.模板浓度越低，染料法的误差越大误差分析及操作规范2.某一孔荧光信号特别强原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；3.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，误差分析及操作规范4.部分样本扩增效率过低原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；误差分析及操作规范5.阴性对照或空白对照翘尾原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；误差分析及操作规范6.直线型扩增曲线原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；误差分析及操作规范7.山坡形曲线原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。误差分析及操作规范8.扩增曲线断裂原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据误差分析及操作规范9.基线下滑原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；误差分析及操作规范10.没有扩增曲线原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段；②电脑设定了自动休眠；误差分析及操作规范11.扩增曲线有一向上或向下的尖峰原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；误差分析及操作规范数据分析软件系统分析方法上机RT样品制备模板准备相对定量：2－△△Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒标准品的制备拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算方法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测试剂：DBI公司SYBRrealtimePCR试剂标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取RNA并反转录；设计特异引物；荧光定量扩增；结果分析：获取样品中目的基因的精确copy数。绝对定量实验例Sam