如何迎接临床基因诊断实验室验收

临床基因诊断实验室技术准入的缺陷分析江苏省临床检验中心许斌我国医学实验室管理国家实验室认可委员会（CNAS）：依据-ISO15189；国家认可；自愿卫生部执业认证：《医疗机构临床实验室管理办法》为加强医疗机构临床实验室管理，提高临床检验水平，保证医疗质量和医疗安全，卫生部出台并决定自2006年6月1日起施行。《办法》包括总则、医疗机构临床实验室管理的一般规定、质量管理、安全管理、监督管理、附则等六章五十六条。各省细则：《江苏省医院检验科建设管理规范》省、市临床检验中心，强制，【体系+能力】PCR实验室技术准入依据和标准《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[2002]8号《临床基因扩增检验实验室现场技术验收表》十章三十八款美国NCCLS对NAT的法规(一)1993年─1995年12月（MM3-A,已批准）NAT用于传染病的规定2000年（MM1-A,已批准）NAT用于遗传病的规定2000年（MM5-P,审定中）NAT用于血液病的规定2001年（MM6-P,审定中）定量NAT用于传染病的规定2001年（MM7-P,审定中）原位杂交NAT用于遗传病的规定美国NCCLS对NAT的法规(二)2002年正在编写中的MM9NAT用于遗传病的规定MM10遗传病的基因型鉴定MM11NAT用于细菌分裂MM12点阵式NAT在临检中的应用方法MM13NAT的样品制备MM14NAT的质控MM15NAT在“人类基因组”应用中的规定●物理的:分区及单向流动、专用移液器、一次性试管架、紫外灯、PCR工作罩、滤芯吸嘴。●化学的：dUTP/UNGPCR产物防污染系统、DNA清洁液。●方法学的：即时Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RTPCR一步法。●制度和操作规范（维护保养、执行）缺陷一、防污染意识和措施固定移液器易耗品PCR方法学/防污染两步法RNAcDNAPCR一步法RNAPCRCT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman动力学(CaliperAG-9900自动加样)LabonaChip封闭废液孔RTTaqTth(RT+Taq)扩增中以脱氧尿苷(dUTP)取代脱氧胸苷(dTTP)，扩增产物可被尿苷酶(UNG)消解，在经加热处理，即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板被扩增。后续扩增进行之前在PCR反应体系中加入UNG处理，在预变性加热后，可能的产物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假阳性”的图解这种“假阳性”是由于污染了前次PCR产物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加热PCRUNG/dUTP系统实验室分区原则单一流向、明确的识别标记各区仪器设备物品配备的充分性和科学性防污染分区南通医学院附属医院临床基因诊断实验室布局及人流、物流平面示意图产物分析区PCR扩增区样品准备区试剂准备区样品接收区工作走向门门门门门单口洗眼器900传递窗2000177010502800洗涤室急诊室生化室临检室2500300026005009009009005000500050002496标本处理电脑输出PCR1缓冲PCR2缓冲缓冲PCR3PCR4缓冲3000490017006100500ABBBBBBBBA2550450015007506000750冰库库房杂物间二楼实验室设备水电分布图项目说明编号名称规格（W*D*Hmm)数量配置A中央水柜1500*750*80020钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽（其中4组带洗眼器）B边台1500*750*80078钢木结构，13mm黑色TRESPA板C边台2600*500*8001钢木结构，18mm黑色大理石台面，带活动盖板D采血台6100*500*8001钢木结构，18mm黑色大理石台面E采血台10000*500*8001钢木结构，18mm黑色大理石台面F接样台5850*500*8001钢木结构，18mm黑色大理石台面G边台5800*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽H电脑台2550*750*8001钢木结构，27mm灰色防火板台面I电脑台4500*750*8001钢木结构，27mm灰色防火板台面J边台3000*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽K边台4900*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽L边台2900*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽M边台2800*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽N边台2100*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽O边台3800*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽P标本柜900*500*20005铝木结构，带活动层板Q边台5100*750*8001钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带两套三口水龙头/PP大水槽，一套三口龙头/冷热水/PP水槽R器皿柜900*500*20003铝木结构，抗倍特层板S手推车800*450*85015不锈钢制，双层T紧急淋浴器1落地式，带洗眼**传递窗685*590*8004机械联锁900标本室空调机房微生物室微生物室5100缺陷二、档案管理仪器档案（a）制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；（b）仪器使用说明书或其复印件；（c）校准/检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期；（d）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；（e）损坏、故障、改装或修理的历史。人员档案实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。缺陷三、记录内容形式保存缺陷四、质量控制SOP文件的现行有效性仪器的标志及维护保养试剂及耗品的质检PCR检测流程标本采集核酸提取基因扩增产物检测采集的方法核酸的稳定性保存分离方法*效率保存效率检测方法*测定的线性*DNA、RNA的浓度和纯度测定及保存此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于2.5ug/ml的核酸。测定时将样品作适度的稀释。用紫外分光光度仪检测，记录280nm和260nm处的吸光度。280nm为蛋白吸收峰，260nm为核酸吸收峰。其中260nm处读数用来计算样品的核酸浓度。1、紫外分光光度法10D/A260nm=50ug/ml双链DNA10D/A260nm=33ug/ml单链DNA10D/A260nm=40ug/mlRNADNA总产量（ug）=OD(A260nm)×50ug×稀释倍数×样品总体积DNA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)×50×稀释倍数提取RNA总产量（ug）=OD值(A260nm)×40ug×稀释倍数×样品总体积RNA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)×40×稀释倍数2、琼脂糖凝胶微型电泳法未知浓度的微量DNA片段可与已知浓度的DNA同时电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各DNA的体积要准，否则会有误差。3、纯度检查天然DNA的吸光度比值为A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515纯DNA液的A260:A280:应为1.8-1.9。如比值低于1.6时，这提示有蛋白质和酚的污染，应进一步纯化。4、RNA完整性检查常用变性的琼脂糖电泳法检查，常用的变性剂为甲醛、乙二醛和羟甲基汞。完整的RNA经变性电泳后能分离出核糖体RNA中的28S和18S，且EB的显色强度应为2:1左右。如28S带降低而18S带增加则表示RNA标本有所降解。5、DNA、RNA的保存4℃是DNA保存的最佳和最简单的条件之一。-70℃可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/LTris-Hcl，1mmol/LEDTA，PH8.0），4℃储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin），终浓度为2U/10μl，置-20℃保存备用。血清标志物用于疾病诊断、流行病调查基因检测用于疗效监控、预后判断样品筛查检测筛查试剂阳性反应阴性反应重复检测原有试剂加另外一种筛查试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应送确认实验室进行确认阴性报告HIV抗体筛查试验流程图英国HBV血清学诊断的SOP(V.SOP6)HBsAgAssayNegativeReaciveReport:HBsAgNegativeConfirmatoryHBsAgtestfromclotaccoringtoassayandlocalprotcal(egneutralisationorsecondHBsAg)NegativeReactiveV.SOP7Repeat1stassayfromclot(ifavailble)BothtestsNegative1streactive2ndnegativeAnti-HBctestReportHBsAgnegativeAnti-HBcNegativeAnti-HBcReactiveReport:HBsAgequivocalRequestfurthsampleReport:Anti-HBcReactive.FurthertestAnti-HBbcIgM,HBeAg/anti-HBeandrequestafurthersample实验室检测抗-HCV程序抗-HCVEIA阴性报告RR阳性S/CO比值3.8抗-HCVRIBAHCVRNANAT阴性其他结果评价(如NAT、ALT)阴性阳性可疑阳性RR阳性S/CO3.8或报告报告报告报告报告我们如何选择合适的替代终点以合理考评疗效?HBsAg消失-完全应答HBVDNA清除或抑制-病毒学应答‘e’血清转化（HBeAg消失+抗HBe产生）-病毒学应答ALT恢复正常-生化应答肝脏组织学表现-组织学应答还是联合应答？HBVDNA清除或抑制？优点:HBVDNA抑制表示HBV复制的抑制水平，与HBeAg消失和/或ALT恢复正常相关。缺点:不可能完全清除,不能反映持续应答抑制程度:105(AASLDguideline)还是104(AGAPanelrecommendation*)?检测没有国际单位:无法采用标准化单位报告结果（copies/mL、pg/mL、meq/mL、logdrop）敏感性不同阻碍了对治疗效果的比较*PhairJNATURALHISTORY,DIAGNOSTICS,ANDCLINICALPROFILESOFPERSONSWITHCHRONICHEPATITISB核酸检测要点灵敏度，50copy/ml特异性分型突变定量的一致性疗效观察、验证诊断定量PCR技术标准品（Panel）•SDA:参照WHOHBVStandard英国NIBSC(97/746)Adw106IU/ml等于2.65×106拷贝/毫升PanelNo:L0L1L2L3L4L5•CNCCL:HBVDNA1PanelNo:1，2，3，4，5•国家标准局基质问题：基质(Matrix)真实血样：样品纯度和抑制剂PCR定量方法的比较实时法Taqman终点法Taqman终点酶标或芯片法外标法7000,96孔,四波长I-cycler,96孔,四波长Light-cycler,32孔,三波长cutoff值104/ml用于定量的必要条件：1.样品纯度高2.CT值必须小于353.定量试剂的生产文号内标法COBAS-Taqman,4×24孔，四波长cutoff值50/ml用于定量的必要条件：1.终点循环数必须小于352.定量试剂的生产文号FX-990，FS-1000，FT-2000，DA620等cutoff值105/ml用于定量的必要件：1.样品纯度高