重组人干扰素α-2b

重组人干扰素α-2b生产工艺设计(赵杨杨，河南城建学院，平顶山，4567000)摘要：重组人干扰素α-2b(rIFN2b)是一种广谱抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能的药物。干扰素是病毒进入机体后诱导宿主细胞产生的反应物，它从细胞释放后可促使其他细胞抵抗病毒的感染，干扰素增强免疫功能的机理是：调节机体的免疫监视，防御和稳定功能，使杀伤(NK)细胞、Tc细胞的细胞毒杀伤作用增强；使吞噬细胞的活力增强；诱导外周血液中单核细胞活性；增加或诱导细胞表皮主要组织相容复合物抗原的表达。临床用于治疗多发性骨髓病，后天免疫缺损症(AIDS)病人所患的卡波济肉瘤、恶性黑色素瘤、毛状细胞白血病及慢性活动性乙型肝炎。关键词：重组人干扰素α-2b、菌种构建、分离、纯化、检测1.基因工程假单胞杆菌菌种的建立1.1干扰素基因的克隆从感染新城疫病毒的人血红白细胞中分离干扰素α-2b基因的mRNA，由逆转录酶将Poly（A）RNA反转录形成cRNA第一链。再由DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二条链。在dCTP存在的条件下，利用末端转移酶给cDNA加Poly（dC)尾，连接到质粒pBR322上。转化到大肠杆菌感受态细胞中，并用氨苄青霉素和四环素筛选抗性克隆，获得编码人干扰素α-2b的基因序列。1.2干扰素表达载体的构建把干扰素基因与宿主载体pAYC37连接，筛选出序列正确的表达载体pVG。将表达载体导入假单胞杆菌中，筛选得到干扰素工程菌，表达重组人干扰素-α-2b不低于2.0×109IU/L，并具有氨苄青霉素、四环素和链霉素的抗性。2.重组人干扰素α-2b发酵与纯化2.1重组人干扰素α-2b工程菌的发酵取菌种1ml接种于100mlLB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)的锥型瓶中,摇床30℃震荡培养6~7h,OD值达0.6~0.7h,按1∶20的比例转种于1000mlLB培养基中,摇床30℃震荡培养7~8h,OD值达1.0~1.2h,接种30L发酵罐中,30℃培养4~5h后,42℃培养4h,离心收集菌体。2.2菌体破碎及包涵体的提取将菌体加入A液悬浮洗涤3~5次,取洗涤后的菌体加入4倍体积的A液,冰浴条件下超声破碎15次,30s/次,每次间隔30s,离心收集沉淀,加入B液和C液各洗涤3次,离心后收集沉淀物即为包涵体。2.3包涵体的溶解及复性包涵体加入5倍体积的D液,冰浴条件下,抽提2h,再将抽提液迅速用E液100倍稀释,4℃放置2h后装透析袋,于20倍体积的F液透析20~24h。2.4重组人干扰素α2b的纯化离子交换柱层析:采用DEAESepharose(FF)柱,柱型XK30/50。用F液平衡后,将上述透析后的复性液样品上样,流速为20ml/min,上样结束后,以含不同浓度NaCl的F液洗脱,收集干扰素活性峰。选用Sephacryl00/50XK层析柱,S-100填料,柱体积1700ml,用G液平衡后,将离子交换柱层析收集的干扰素活性峰样品经凝胶过滤,上样量为柱床体积的5%,再收集干扰素活性峰,合并样品进行以下检定。3.重组人干扰素α-2b的检定[2]3.1生物学活性检测选用微量细胞病变抑制法(Wish细胞-VSV病毒系统)进行检测。3.1.1将ⅦSH细胞(人羊膜传代细胞株)接种于96孔培养板，置37℃5％CO2温箱中培养12—18h使其生长成单层。3.1.2去除营养液，依次加入系列稀释的IFN检品，每个稀释度各加2孔。同时设不同稀释度的IFN标准品对照，细胞对照和病毒对照。37℃5％CO2温箱中孵育过夜。3.1.3去除IFN溶液，用100TCID5的VSV攻击(细胞对照孔加不含病毒的营养液)，再培养1—2do待病毒对照孔细胞全部或75％以上出现明显病变时，即可在倒置显微镜下观察结果或用结晶紫将细胞染色后，肉眼观察结果。3.2蛋白浓度测定选用Lowry法测定,标准蛋白由中国药品生物制品检定所提供。3.3电泳纯度检测选用非还原SDS-PAGE电泳,浓缩胶4.5%,分离胶13.5%,银染法染色后,CS930扫描仪扫描,波长370μm。3.4HPLC纯度检测选用Protein-PAKl25色谱柱检测。3.5分子量的测定选用还原型SDS-PAGE电泳,以Pharmacia公司分子量标准品为对照,CS930扫描仪扫描后,计算结果。3.6紫外光谱扫描全波长紫外光谱扫描,读取最大吸收峰值。3.7残余DNA含量测定用地高辛法测定。3.8残余宿主菌蛋白含量测定用ELISA法测定。参考文献：[1]吴梧桐,王友同,吴文俊.21世纪生物工程药物的发展与展望.药物生物技术2000,7(2):65-70.[2]中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程〔S〕.2000版,化学工业出版社,2000年.[3]刘凡实,姜崴,隋宝真.重组人干扰素α-2b的提取和纯化.微生物学免疫学进展.2004,32(1):13~16.[4]石晓丽,万里,王东倩,等.重组α-2b型人干扰素工程菌菌种稳定性试验.中国生物制品学杂志.1999,12(3):149~150.[5]赵广荣.重组人干扰素的研究进展.中国生物制品学杂志.2010,23(12):1384~1388.[6]元英进，赵光荣，孙铁民.制药工艺学.2007年7月，化学工业出版社，2011年.