免疫组化EnVision二步法染色

石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色第一组2组一、实验目的：1.掌握石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的原理、步骤及结果分析2.了解石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的临床应用二、实验原理：免疫组织化学技术是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。EnVision二步法染色是通过一个葡聚糖分子，将多个抗小鼠或抗兔的二抗与多个辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）或碱性磷酸酶（AP)聚合在一起，形成一个免疫组化检测系统。显色原理：将抗原抗体结合的部位显示出来。常用ＤＡＢ（３’３－二氨基联苯胺）：阳性细胞染成棕黄色(ＨＲＰ显色剂)，苏木素复染，核淡兰色，显色反应稳定，不褪色，应用最广。显色原理：酶－－催化剂Ｈ2Ｏ２－－底物ＤＡＢ－－供氢体反应原理：ＨＲＰ＋Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２ＤＡＢ↓(第一复合物)ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ＋Ｈ２Ｏ＋电子供体(氧化型)生成不溶于水和有机溶剂的有色终产物(棕褐色颗粒)和水，沉着在原来的位置上。三、实验试剂与器材：试剂：二甲苯试剂，梯度乙醇（70%、80%、90%、100%、），蒸馏水，3%H2O2，柠檬酸盐缓冲液，PBS（磷酸盐缓冲液），鼠抗人CK，鼠抗人C-erbB-2，HRPanti-Mouse/Rabbit，DAB显色剂，苏木素试剂，1%盐酸乙醇，中性树胶，自来水器材：试剂缸、试剂瓶若干；载玻片及盖玻片若干；架子；石蜡切片；微波炉;37度恒温箱；显微镜四、实验地点：科技十楼，病理实验室五、实验时间：2011.12.21六、组员及分工：11120062申海涛，11120111黄冉冉，11120114谭辉，11120140谭丽，11120145张力，分别参与各步骤操作与计时。七、记录人：黄冉冉八、实验步骤：1.二甲苯10minX2次2.梯度梯度乙醇水化，100%、90%、80%、70%由高到低每缸浸泡1min3.蒸馏水洗片刻4.3%H2O2去除内源性酶，室温10min5.蒸馏水洗3minX2次6.食管癌（CK）、乳腺癌（C-erbB-2）切片微波抗原修复（将切片放入柠檬酸盐缓冲液放入微波炉待煮沸后沸腾15min，室温冷却）7.蒸馏水洗3minX2次8.PBS洗3minX2次9.加鼠抗人CK（50微升）孵育1小时37°C，鼠抗人C-erbB-2（50微升）孵育1小时37°C10.PBS洗3minX2次11.（CK、C-erbB-2）：加HRPanti-Mouse/Rabbit孵育30min37°C12.PBS洗3minX2次13.DAB显色（棕褐色），镜下控制；（镜下观察细胞膜染色即可冲洗）14.自来水冲洗5min15.苏木素复染，水洗16.1%盐酸乙醇分色2s，水洗17.梯度梯度乙醇脱水，70%、80%、90%、100%由低到高每缸浸泡2min18.切片风干后中性树胶封片九、实验结果与分析：食管癌CK：结果：低倍显微镜下观察染色阳性染色强，阳性颗粒定位性佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色。高倍镜下见癌巢组织内，可见大量细胞，胞浆呈棕黄色、核呈蓝紫色，堆积成癌巢。细胞间隙可见透明或淡色的背景为未染色间质成分。部分可见无核、疏松淡染的结构堆积为坏死成分。部分可见细胞核蓝紫色胞浆淡色或透明为坏死细胞核固缩。分析：由原理得胞浆呈棕黄色为抗原抗体结合的部位，可以得知在食管癌CK因子表达在细胞胞浆。乳腺癌C-erbB-2：结果：低倍显微镜下观察染色阳性染色强，阳性颗粒定位性佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色。高倍镜下见癌巢组织内，可见大量细胞，胞膜呈棕黄色、胞浆透明或淡色、核呈淡蓝色，堆积成癌巢。细胞间隙可见透明或淡色的背景为未染色间质成分。部分可见无核、疏松淡染的结构堆积为坏死成分。部分可见正常的腺体官腔结构。分析：由原理得胞膜呈棕黄色为抗原抗体结合的部位，可以得知在乳腺癌C-erbB-2因子表达在细胞胞膜。十、注意事项：1.脱蜡要彻底，应定期更换脱蜡液。2.DAB染色时间控制要适当。3.染色、分化的时间要恰当掌握，可镜下观察着色情况。本组实验成员：11120062申海涛11120111黄冉冉11120114谭辉11120140谭丽11120145张力CKC-erbB-2