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2008年5月1一次性使用医疗用品初始污染菌检测江苏省医疗器械检验所一次性器具室2008年5月2微生物基础知识•微生物基础知识•无菌技术•初始污染菌检测关键步骤•致病菌检查2008年5月3微生物学检查无菌检查微生物限度检查细菌、真菌数量控制菌其他（初始污染菌）2008年5月4微生物基础知识•微生物与微生物学自然界中存在着一个数量极其庞大、个体微小和结构简单的生物类群，即微生物。微生物大多数为单细胞，必须借助光学显微镜放大千倍或电子显微镜放大数万倍才能肉眼可见的一类微小生物的统称。微生物学是研究微生物的形态结构、分类、生理代谢、遗传变异、生态分布和微生物与人类、动植物关系等的一门学科。我们对微生物深入研究的目的在于更好地开发微生物资源，充分利用微生物有利于人类生活方面。控制微生物的有害方面，使之更好地为人类服务。2008年5月5微生物的分类微生物非细胞型微生物原核细胞型微生物真核细胞型微生物病毒亚病毒因子细菌放线菌衣原体支原体等真菌原生生物2008年5月6细菌形态特征•细菌个体形态细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm,0.5-5μm）、结构简单、细胞壁坚韧以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物，分布广泛。形态图•细菌菌落形态单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。可作为鉴定细菌种的依据。菌落图2008年5月7细菌形态特征2008年5月8细菌形态特征粘质沙雷氏菌的菌落特征2008年5月9细菌形态特征铜绿假单孢菌的菌落特征2008年5月10细菌形态特征金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。2008年5月11细菌形态特征金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。2008年5月12细菌形态特征描述1.大小：直径2.形状：圆形、假根形、不规则型3.隆起形状：扩展、苔状、低凸、凸面、乳头状4.边缘：整齐、波状、裂叶状、圆锯齿状、有缘毛5.表面状态：光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状、同心环状6.表面光泽：闪光、不闪光、金属光泽7.质地：油脂状、膜状、脆8.透明程度：不透明、半透明•细菌菌落的常规描述2008年5月13细菌形态特征•细菌基本结构荚膜细胞壁胞浆膜核蛋白核质2008年5月14细菌形态特征•革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较细胞壁结构G＋G－厚度20－80nm10－15nm强度坚韧疏松糖类含量约45％约15％脂类含量约2％约20％磷壁酸无有脂多糖无有脂多糖（LPS）,包括脂蛋白A，核心多糖和特异性多糖三个部分。LPS对动物具有毒性作用，它牢固地结合在细胞表面，只在菌体融解时才释放，称为细菌内毒素。其中脂蛋白A是内毒素的主要生物学活性组分。2008年5月15真菌形态特征•霉菌个体形态霉菌亦称丝状真菌，是在分类学上很不相同的许多真菌的一部分，凡是生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌，霉菌为真核微生物，其结构比细菌复杂。•酵母菌个体形态酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。2008年5月16霉菌形态特征由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径1~2厘米或更小。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。2008年5月17酵母菌形态特征啤酒酵母的菌落大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。2008年5月18微生物群体生长规律将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。•规律的描述•规律示意图2008年5月19微生物群体生长规律延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。对数期：对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。2008年5月20微生物操作技术－无菌环境是前提！主要是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌实验器材等，统称为无菌技术。无菌环境的应用是一个完整的操作技术体系。若其中的任何一个环节污染，那么其他环节虽是无菌操作，也将完全失去意义。无菌技术概念•无菌环境无菌环境是指人们用物理的或化学的方法，在某一可控的空间内使微生物数量降低到最低限度，接近于无菌的一种空间。2008年5月21试验环境的要求及无菌操作•环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。•阳性实验室、检查间分离。•严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。•无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室。2008年5月22无菌技术1.技术培训和考核制度2.仪器和试剂的校对制度3.实验记录制度4.结果质疑和核对制度5.技术方法的规范制度•实验室安全制度1.安全通则2.生物安全•微生物检验质量控制制度2008年5月23无菌技术•菌种•菌种保藏原理保藏的原则是根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。•菌种保藏步骤选择典型菌落确定菌体形态选择保藏方法定期检查方法主要原理适用的微生物包藏时间特点琼脂斜面低温保藏法低温（4℃）广泛1～6个月简便液体石蜡保藏法低温，缺氧广泛1年以上简便干燥（砂土）保藏法干燥，无营养产孢微生物1～10年简便有效冷冻真空干燥法干燥，缺氧、低温广泛5～10年复杂但有效液氮超低温保藏法超低温广泛数十年复杂但有效•菌种保藏方法2008年5月24无菌技术•琼脂斜面低温保存法•方法•适用范围•特点•注意事项将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，4度冰箱保藏。每隔1个月移种一次，继续进行保藏。本法适用与经常使用的细菌、酵母菌等。（1）优点：简便，易推广；一般不需要另选则保藏用培养基；对大多数都适用。（2）缺点：保藏期短；传代次数多，易变异和污染。（1）保藏菌种的选择。（2）定期检查。（3）做好记录。2008年5月25无菌技术•半固体石蜡保存法•方法•适用范围•特点•注意事项用石蜡让培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏时间。本法适用与部分霉菌、酵母菌和放线菌等，对细菌的效果较差。（1）优点：简便，易推广。（1）液体石蜡的高度。（2）定期检查。（3）做好记录。2008年5月26无菌技术•斜面培养基接种技术•方法1.左手持分离培养的平板培养基，右手持接种环，经火焰烧灼，冷却后在平板上挑取菌落。2.左手立即放下平板，换持斜面培养基，用右手小指和无名指拔出管塞，夹持于手指之间。3.将管口在火焰上通过两三次，但勿烧烫。再迅速将挑取有菌的接种环伸进斜面内，从斜面的底部向上划一条接种线，又自下而上蜿蜒接种成曲线。4.退出接种环，塞上管塞。接种环经火焰灭菌后放置。5.培养后，沿接种线长出菌苔，非接种线的部位应无细菌生长。2008年5月27无菌技术•分离技术•划线分离法分段划线法组段间接种环的灭菌、冷却！2008年5月28无菌技术•金黄色葡萄球菌的保藏一般为冻干粉剂，安瓿瓶密封包装。选择性培养基分离菌种。增菌性培养选择性培养基分离菌种。斜面接种、培养低温保藏2008年5月29无菌技术•无菌器材实验器材灭菌器材消毒器材凡是检验中使用的器材，能灭菌处理的，必须灭菌处理。如：玻璃器皿、吸管、培养基、稀释剂、无菌衣、口罩等，在使用前必须经过适当方法灭菌，并在较洁净的环境中保存备用。凡检验用器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如：无菌室的桌凳、天平、工作台以及工作人员的手等。2008年5月30无菌技术•无菌操作基本概念：无菌操作一般是指在无菌环境条件下，使用无菌制品或无菌器材进行检验或实验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。操作目的：（1）保证检验物品不被环境中的微生物的污染；（2）防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境。主要方面：（1）实验前的准备（2）实验中的操作（3）意外事故的处理2008年5月31无菌技术•进入无菌室的控制1、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；2、无菌室在使用前开启紫外线灯30~60min进行空气消毒；3、在进行接种倾注琼脂平板均需在无菌室超净工作台或接种罩内操作3、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒的标志物是否完备；4、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓10～15s，肥皂虽不杀菌，有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂住菌，如连续洗2～3次(视手的污染程度)，使残余的微生物减少到最低水平，再用消毒液洗手，如洗必泰、苯扎溴铵、碘伏、乙醇、过氧乙酸等。5、操作人员将手部消毒后，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩等)。严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及袖口是紧口的，以保护身体，防止污染。一般的无菌衣是背开口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。6、在进入无菌室后，进一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手，然后可进行检验或实验操作。2008年5月32无菌技术•检验过程的控制1、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘埃微粒。2、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。3、在近火焰区操作。4、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。5、应用橡胶乳头套在吸管上端，吸吹供试液或培养液等，切勿用嘴直接吸吹吸管。6、用注射器吸取样品、培养物时，注射器内应无空气；装卸针头时应用灭菌的镊子；从密封容器内抽取液体时，应注入无菌空气；带液体的针筒针头应向上倾斜，并用75%乙醇棉球(挤干)保护针头根部；注射时勿用力过猛，以免内容物喷出或针头脱落使溢出液体污染灭菌器材或环境。7、当灭菌瓶塞或试管塞