幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制

幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制【摘要】目的建立一种快速检测抗H.pyloriIgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。方法以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ml。SPA标记的最适pH为6.0。以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间阳性率比较差异无显著性。结论胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。【关键词】幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测ResearchondevelopmentofgoldimmunochromatographictestkitforserumH.pyloriantibodyIgG【Abstract】ObjectiveDevelopinggoldimmunochromatographictestkitforserumH.pyloriantibodyIgGandoptimizethekeyexperimentconditions.MethodsPreparingthecolloidgoldparticlesof20nmwhichwerecoupledwithStreptococcusproteinA(SPA)，setupthegoldimmunochromatographytestkitforserumH.pyloriantibodyIgG.ResultsThespheroidalcolloidgoldparticlesof20nmisshownincolorofbrightred.Theminimalstableconcentration(MSC)ofgold-SPAis5μg/ml，andthesuitablestableconcentration(SSC)is6μg/ml.ThepH6.0isappropriate.53serasamplesweretestedbyGICAandELISA，thereisonsignificantdifferencebetweentwomethods.ConclusionThequalityofgoldimmunochromatographytestkitisassociatedwiththefactors，suchasthequalityandquantityofantigenorantibody，colloidgoldparticles，buffers，etc.【Keywords】helicobacterpylori;colloidgold;goldimmunochromatographicassay在幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测（goldimmunochromagraphyassay，GICA），操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，特别适于基层卫生单位使用。本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA）抗原，尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂，优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件，为进一步研制和开发奠定实验基础。1材料与方法1.1材料幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存；TSB肉汤（Trypticsoybroth）为DIFCO公司产品；氯金酸（HAuCl4.H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG20000），FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。厌氧培养罐AnaeroPackRectangularJar为三菱化学公司产品。1.2方法1.2.1玻璃器皿的清洁制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。1.2.2胶体金颗粒的制备取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。1.2.3免疫胶体金复合物的制备1.2.3.1胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9～6.2，取11支洁净试管分装胶体金溶液（1ml/管）。将待标记蛋白质SPA逐级稀释后（由2～10μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置。依表1顺序进行。表1胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验（略）(1)室温静置2h以上观察结果；(2)未加SPA的11号管为对照管；1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。1.2.3.2最适标记pH的确定调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低稳定量实验，确定标记蛋白的最佳标记pH。1.2.3.3SPA标记胶体金当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9～6.2），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。分别取1ml胶体金-SPA结合物液（实验组）和1ml胶体金原液（对照组）于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白SPA。最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEGMW20000），继续搅拌30min。1.2.4胶体金标记SPA复合物的纯化超速离心法纯化免疫胶体金复合物。先以3500rpm离心20min（4℃），弃沉淀将上清以13500rpm离心35min（4℃），弃上清，用保存液悬起较疏松的红色沉积物；再以11000rpm离心35min（4℃），小心移弃上清后，用保存液悬起较疏松的红色沉积物至原体积1/10，即为初步纯化的免疫胶体金复合物。1.2.5胶体金标记蛋白质的检定定量测定：以保存液作对照测530nm处OD值，4℃避光保存。质量鉴定：用有Formvar膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀负染，在Tecnai10透射电镜下观察。1.2.6金标垫的制备1.2.6.1免疫胶体金复合物稀释度的确定纯化的胶体金标记SPA作不同程度稀释后，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。组装试纸条，在其他条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记SPA的稀释度，或称为工作浓度。1.2.6.2金标垫的制备保存液稀释胶体金标记SPA复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。1.2.7H.pylori全菌超声粉碎抗原的制备［1］幽门螺杆菌SS1采用TSB固体斜面培养基微需氧（5%O2、10%CO2、85%N2）37℃培养，72h后转种TSB液体培养基，37℃振荡培养60h后收集菌体。H.pylori菌体用小体积生理盐水悬浮，冰浴条件下超声粉碎有效时间5min（150W），超声粉碎置显微镜下观察呈均匀细颗粒状；4℃，12000r/min离心20min，收集上清；细菌沉渣再重复超声5min，重复离心过程取上清；合并2次上清，于0.01mol/L的PB缓冲液（pH7.2）中透析24h，中间换液3次，最后12000r/min离心20min，上清测蛋白浓度后分装，于-20℃保存。1.2.8H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备H.pylor抗原室温融化后，12000r/min离心10min，取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液（pH7.2）以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带（T），距离检测带5mm远的质控带（C）用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存。1.2.9样品垫的处理选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。1.2.10试纸条组装根据功能不同可将试纸条分为四个部分：上段（A区）为手持部位（吸水滤纸：吸收检测样品中多余液体），中段（B区）为实验反应区（硝酸纤维素膜：包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C），下段（D区）为样品区（玻璃纤维素膜：接触待检测样品），在中下段之间（C区）放置浸有胶体金标记SPA复合物的金标垫；而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板（见图1）。1.3临床血清标本H.pylor抗体IgG检测取1998年3月～2001年9月期间在我院消化门诊就诊，临床诊断为幽门螺杆菌胃炎患儿血清53份。加入80μl于试纸条样品区，2～5min开始观察结果，20min观察终止。出现1条红色（对照）沉淀线，为血清学诊断阴性；出现2条红色（样品和对照）沉淀线，为血清学诊断阳性。同时采用华美生物工程公司ELISA试剂盒对血清标本进行对照检测。组间阳性率采用U检验分析。2实验结果2.1胶体金颗粒制备我们实验所用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色，用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸胶体金后在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀，圆形（图2）。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。2.2胶体金标记SPA的最低稳定浓度、最适稳定量及最适pH加入不同浓度SPA的胶体金溶液在加入氯化钠后呈现不同颜色（由蓝色伴聚合物沉淀逐渐过渡到亮红色），使胶体金溶液红色不变而蛋白质含量最低的试管中加入5μgSPA，因此确定本次制备的20nm胶体金标记SPA的最低稳定量是每毫升胶体金溶液5μgSPA，最适稳定量为每毫升胶体金溶液6μgSPA。胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，实验证实SPA标记的最适pH为6.0，符合理论预测。2.3胶体金标记SPA复合物的制备与纯化将胶体金溶液pH值调至6.0，30ml胶体金溶液在磁力搅拌下缓缓加入180μlSPA溶液（1mg/ml），加入PEG20000增加胶体金溶液的稳定性，超速离心纯化后在Tecnai10透射电镜下观察，可见金颗粒外围有明显的低电子密度晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白（图3）