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第三部分重组DNA导入受体细胞?一、受体细胞?二、选择受体细胞的基本原则?三、重组DNA导入受体细胞的方法1、转化概念转化：DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化（Transformation）。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在DNA重组技术中统称为转化操作。一、重组DNA转化感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。2、细菌转化的步骤：?感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等。?转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。?转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。?整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。?转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。二、受体细胞?受体细胞(receptorcell)：又称为宿主细胞(hostcell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞?感受态(competence)：是指细菌吸收外源DNA的生理状态。?感受态细胞(competencecell)：是指具有接受外源DNA能力的细胞。1、原核生物细胞的优点?大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。?没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦?基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。?原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。?原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。?原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。?原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞?大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。?优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。?缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素可导致人体热原反应。枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：?枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。?枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。?枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。?枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。?应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。蓝细菌（蓝藻）蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ)和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：?基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。?细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。?营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。?多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。?蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。4、真核生物细胞真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。酵母菌酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点?酵母菌是结构最为简单的真核生物之一,其基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对较为简单。?具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。?不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属(如酿酒酵母)在仪器工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。?培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。?能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。动物细胞?常用的动物受体细胞有Hela细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞(CHO)等。?哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：?能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的RNA。?真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞16-20倍。?易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。?经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。?缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子CHO细胞，通常需要数月之久,难度较大。?目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。?常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点植物受体细胞?优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。?缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。?现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。5、选择受体细胞的基本原则?便于重组DNA分子的导入。?便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。?遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。?受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。?安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。?能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。?受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。?具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。?在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。6、受体细胞应具备的条件野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株通常应从以下几个方面加以考虑：从安全性考虑，应具备以下条件：?不适合在人体内生存?不适合在非培养条件下生存?在非培养条件下，其DNA容易解体?它的DNA不易转移?它的质粒只在这一宿主由复制?便于检测从遗传性考虑：?重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）?限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）?与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型）?具有较高的转化效率限制缺陷型?这是导致外源重组DNA转化或转导效率低下的主要原因之一。?应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源DNA分子的转化或转导效率。?进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不能修饰，也不能限制外源DNA分子，更便于重组DNA分子的多种基因操作。?大肠杆菌的限制系统主要由hsdR基因编码，因此具有hsdR-遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。重组缺陷型?进入野生型细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生的体内同源重组反应由rec基因家族的编码产物所控制。RecA蛋白能促进DNA分子之间的同源联会和DNA单链交换，recA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至106。?大肠杆菌的recB、recC和recD基因分别编码不同分子量的多肽链，三者构成一个在同源重组中的统一功能单位—RecBCD蛋白（核酸酶V），它具有依赖于ATP的双链DNA外切酶和单链DNA内切酶双重活性。recB、recC和recD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率?因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型基因型为recA-、recB-或recC-等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。转化亲和型?可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞。遗传互补型?遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。?如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMP抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组DNA分子转入受体细胞后载体上的标记基因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。?如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征．可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。感染寄生缺陷型?相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有感染和寄生效应，重组DNA分子导入这些细菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体内，并广泛围传播，?如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手段制造生物武器不在此例。三、重组DNA导入受体细胞的方法?转化(transformation):指感受态的大肠杆菌细胞捕获质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒DNA分子的过程。?转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。?转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬菌体或以它为载体构建的重组DNA分子的过程?转导(transduction):指病毒转移真核细胞DNA的过程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。?基因导入受体细胞方法?根据转移基因方法特性可分为：?转化(transformat