慢性乙肝诊断和治疗监测中的分子指标

慢性乙肝诊断和治疗监测中的分子指标复星诊断杨志军全球约有3.5－4亿人感染乙肝病毒，尽管大多数感染者可能仅仅是病毒携带者，体内病毒复制程度很低，不会出现肝脏病变，但其中相当一部分人会发展成为慢性肝炎，即HBV在体内复制程度高，肝脏出现坏死性炎症。据估计，约有15－20％的慢性肝炎患者在5年内会发展成为肝硬化，这些肝硬化病人的5年存活率为55－85％，而且，一旦发展成为肝硬化，发生肝细胞癌的风险将大大提高。有人估计，全球每年约有25万人死于HBV引起的肝脏疾病。慢性乙肝治疗的长期目标是防止或者减少肝硬化和肝细胞癌的发生。临床上往往采用比较具体的短期目标：（1）病毒抑制，表现为HbeAg血清转换，HBV-DNA转阴;（2）肝细胞损伤程度降低，表现为ALT恢复正常，肝脏组织学功能改善;(3)完全根除病毒：表现为HbsAg消失，HbeAg血清转换，肝脏和血清中HBV-DNA转阴，肝细胞中检测不到cccDNA。但是，根据目前的治疗水平，完全根除病毒的目标还难以达到。在临床实践中，往往以HbeAg血清转换，ALT复常，HBV-DNA阴转作为治愈的标准，组织学改进只是作为参考，基本上不把根除病毒作为治愈目标。目前在我国批准上市的治疗慢性乙肝的药物主要有干扰素－α，拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦。随着肝炎病毒分子生物学研究的深入，选择治疗方案、评价治疗效果以及停药后的随访中常常需要观察一定的实验室指标，本文将对这些指标及其临床应用进行介绍。HBVDNA血清HBVDNA水平是临床上最常用的分子指标。根据美国肝脏病学会和亚太地区肝脏病学会的指南，血清HBVDNA水平高于105拷贝/毫升就可以认为乙肝病毒处于活动状态。一般情况下，病毒暴露6-12周就可以检测到HBVDNA。慢性感染期的乙肝患者，特别是HBeAg阴性患者，血清HBVDNA水平可能会低于105拷贝/毫升。目前，定量测定患者血清中的HBVDNA已经是乙肝诊断和治疗检测中的常规指标。测定HBVDNA的方法主要有信号扩增和ＰＣＲ两大类型，PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建近年来发展起来的实时荧光ＰＣＲ方法可以连续检测扩增信号，具有更宽的线性范围，能够缩短操作时间，降低交叉污染，并且提高检测效率。其临床应用方式及意义如下：1、慢性乙肝诊断：血清中检测到HBVDNA，如果大于105拷贝/毫升，且表面抗原阳性持续6个月以上，ALT持续或反复升高，则为活动性肝炎；2、用药选择：治疗前血清HBVDNA浓度大于105拷贝/毫升，可以考虑接受抗病毒治疗；3、疗效监测：治疗开始后前三个月每月一次，以后每三个月一次检测HBVDNA；4、耐药判断：治疗过程中HBVDNA出现持续反弹，可考虑出现临床耐药；5、预后判断：停药时血清HBVDNA浓度越高，停药后病情反弹的概率越高；6、跟踪随访：停药后前三个月每月一次，以后每三个月一次检测HBVDNA，跟踪一年。虽然HBVDNA定量检测在乙肝诊断和治疗检测中具有非常重要的作用，但由于检测方法众多，目前还没有标准化，结果之间的可比性较差。仅就国内应用较多的实时荧光PCR方法而言，各种试剂检测结果的差异仍然很大。定量标准赋值的可靠性更是直接影响到检测结果的准确性。对定量标准进行溯源，是实时荧光PCR定量检测HBVDNA方法标准化的重要步骤。YMDD变异拉米夫定能够有效抑制乙肝病毒的复制。由于其耐受性好，副作用小，因而受到患者和临床医生的欢迎，但长期使用拉米夫定容易出现耐药现象，导致病毒反弹甚至病情加重。拉米夫定耐药的主要原因是病毒聚合酶基因发生变异，其中最主要的变异位点就是YMDD功能区的甲硫氨酸（M）变异为缬氨酸（V）或异亮氨酸（Ｉ）。在检测到YMDD变异后，如果继续使用拉米夫定，大多数患者将在1-3个月后出现HBVDNA和ALT反弹。拉米夫定使用一年的耐药比例为20%左右，使用两年耐药比例将上升到40%，使用四年后耐药比例将达到70%，提高剂量并不能降低耐药比例。检测YMDD变异的方法有直接测序、PCR-RFLP、基因芯片、DNA杂交以及实时荧光PCR等。采用实时荧光PCR检测YMDD变PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建异不仅简单易行，而且能够定量测定变异病毒在病毒群体中的相对比例，对调整治疗方案更具有指导意义。这里以复星诊断推出的YMDD突变检测试剂进行简要说明。这种定量方法的基本假定是采用同一扩增体系扩增同一目标片段时扩增效率是相同的。由于检测体系中野生型和突变型的目标片断、探针序列、扩增体系完全一致，只有上游引物序列的最后一个碱基不同，为了计算方便，假定扩增效率相同且等于1，就可以根据突变型检测管与控制管Ct值的差异计算出突变株在病毒群体中的相对比例，计算公式为：突变比例=2-ΔCtx100%，其中ΔCt为控制管Ct值与突变检测管Ct值之差（图1）。如果采用荧光PCR系统中的相对定量软件，就可以直接得到结果而不需进行手工计算。根据这种方法计算的突变比例与ΔCt的大致关系如表1所示（表1）。如果突变比例超过10%，已经没有继续使用拉米夫定治疗的必要。如果突变比例低于10%，继续使用拉米夫定是否有效目前尚不清楚。对于接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者，必须检测YMDD变异，检测方式及意义如下：1、接受拉米夫定治疗前检测YMDD变异：如果已经发现变异病毒，则不宜继续用拉米夫定进行治疗；2、治疗开始后每三个月一次检测YMDD变异：如果出现变异，则考虑修改治疗方案，大多数情况下，从出现YMDD变异到HBVDNA和ALT反弹大约需要1-3个月时间。3、拉米夫定耐药的处理：随着阿德福韦、恩替卡韦的相继上市，对于拉米夫定耐药的乙肝患者有了更多地治疗选择。如果发现YMDD变异，可以考虑联合或更换阿德福韦或恩替卡韦进行治疗，这两种药物都能有效抑制拉米夫定耐药变异病毒，而且能够改善肝脏组织学功能。从目前的临床资料看，阿德福韦和恩替卡韦的耐药率都很低。与拉米夫定相比，恩替卡韦无论是治疗HBeAg阳性乙肝还是HBeAg阴性乙肝，肝组织改善的比例、病毒学应答的比例和ALT复常的比例都显著高于拉米夫定，安全性与耐受与拉米夫定没有显著差异。但能否将恩替卡韦确定为治疗慢性乙肝的首选药物，目前尚没有明确意见。尽管有资料表明联合治疗和序贯治疗可以抑制拉米夫定耐药的出现，但我国2005年病毒性肝炎防治指南并不推荐使用联合治疗，序贯治疗的药物组合、顺序及交替时间还需要进行大量的临床研究。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建方法检测拉米夫定耐药突变，其中I和V突变在病毒群体中各占约10%比例。反应管C，检测总HBV；反应管V，检测V突变；反应管I，检测I突变（ClinicaChimicaActa，inpress）。表1YMDD突变比例与ΔCt的关系ΔCt突变比例0100%3.510%71%100.1%1896位点突变乙肝病毒基因组前C区G1896A突变会产生一个终止密码，从而阻止e抗原的合成。如果1858位点的核苷酸是T，则更容易发生G1896A突变，因此G1896A的筛选依赖于乙肝病毒基因型。亚洲地区病毒基因型以B型和C型为主，这些型别的乙肝病毒1858位点的核苷酸通常为T，因而发生G1896A突变的比例较高。一旦发生G1896A突变，虽然乙肝病毒处于复制状态，但由于e抗原不能合成，因而血清中检测不到HBeAg，临床上表现为HBeAg阴性乙肝。这类患者更容易发生严重的肝脏疾病。对于HBeAg阴性的乙肝患者，如果ALT异常，HBVDNA大于104拷贝/毫升，可考虑检测1896位点突变。对于HBeAg阳性的乙肝PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建患者，如果血清中存在G1896A突变，在抗病毒治疗中更容易出现e抗原血清转换，但这种血清转换往往不是免疫学应答的结果，而是将G1896A突变病毒筛选为优势株，虽然病毒仍然在复制，但不能产生HBeAg，从而发展为HBeAg阴性乙肝，这类患者需要接受更为长期的抗病毒治疗。G1896A突变检测方式及意义如下：1、对于ALT异常，HBVDNA大于104拷贝/毫升，但免疫结果为HBeAg阴性的乙肝患者，如果1896位点发生变异，则需接受更为长期的抗病毒治疗，否则更容易发生肝硬化和肝细胞癌；2、对于接受抗病毒治疗且发生e抗原血清转换的慢性乙肝患者，如果HBVDNA大于104拷贝/毫升，需要检测1896位点突变，如果发生突变，需要继续接受抗病毒治疗。HBVcccDNAHBVcccDNA是乙肝病毒复制的中间体，是病毒RNA转录的模板。肝细胞内存在cccDNA是乙肝病毒复制的最直接证据，也是停药后病毒反弹的最主要原因。所有慢性乙肝患者肝细胞内都能检测到cccDNA，但只有部分患者血清中可以检测到cccDNA。血清中HBVcccDNA是肝细胞损伤的早期指标，与ALT浓度和HBV载量密切相关。拉米夫定和阿德福韦治疗可以降低肝细胞内HBVcccDNA浓度，血清HBVcccDNA水平降低程度可以预测拉米夫定治疗过程中耐药突变的产生，降低幅度越大，出现耐药的比例越低。血清HBVcccDNA水平与肝细胞内HBVcccDNA水平密切相关。HBVcccDNA检测的方式及意义如下：1、治疗前检测HBVcccDNA可以判断病毒是否处于活跃复制阶段；2、治疗一年左右的患者检测HBVcccDNA可以判断病毒清除情况和出现耐药的可能性；3、停药前检测HBVcccDNA可以预测停药后病毒反弹的可能性；4、停药后检测血清HBVcccDNA可以预测病毒反弹；5、肝细胞内HBVcccDNA消失时抗病毒治疗的终极目标。乙肝病毒分型PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建乙肝病毒是高度变异病毒，根据基因组序列的差异可以分为A-H八种亚型，其分布具有明显的地域特征，亚洲地区以B型和C型为主。感染HBVC型的患者更容易发展成为肝硬化和肝细胞癌，容易出现核心启动子区突变，对干扰素治疗应答率低。基因型B容易产生前C区突变，接受抗病毒治疗时更容易出现e抗原血清转换。基因型B与基因型C在病情恶化的频率上无显著差异，但基因型B更容易恶化为急性黄疸性肝炎。从慢性肝炎进展的不同阶段来看，基因型B和基因型C没有显著差异。乙肝病毒亚型与干扰素治疗效果有关，但与核苷类似物治疗效果之间的关系还需进一步明确。乙肝分型的检测方式及意义如下：1、治疗前进行分型检测，根据分型结果选择合适的治疗方案；2、一般情况下，干扰素对C型患者的治疗效果较差，对B型患者的治疗效果较好；核苷类似物治疗不同基因型别的慢性乙肝是否有差异，目前还存在较多争论，尚需进一步确定。慢性乙肝的预防与治疗在我国仍然是一项艰巨的任务。分子指标的出现和应用为慢性乙肝的诊断和治疗拓展了新的视野，但这些指标之间的相互关系及其与生化、免疫和组织学指标的联合应用还需要大量细致的研究。哪些指标及其组合可以作为哪种药物治疗的预测指标，哪些指标及其组合可以作为临床治疗终点的判定指标，仍然需要进一步探索。致谢本文引用大量国内外文献，未能一一注明，在此一并致谢！PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建