蛋白质测序

蛋白质N-末端氨基酸序列分析1概述2蛋白质N-末端氨基酸序列分析的基本原理3蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪4影响序列测定的因素5蛋白质C-末端氨基酸测定序列仪1概述1.1蛋白质序列分析的发展过程蛋白质N-末端氨基酸序列测定(ProteinN-TerminalSequences),也称为氨基酸序列分析。由于蛋白质和肽的一级结构是以氨基酸以肽键的形式连接而成的生物大分子。测定蛋白质序列是通过测定蛋白质分子中氨基酸排列顺序的一种分析方法，所以也称为蛋白质的一级结构测定。随着生物化学和分子生物学学科的发展及高新技术在生物学中的应用,蛋白质序列测定技术发展非常快。开始是手工测定，这种方法既费时又费样品。后来研制出了蛋白质测序仪，通过蛋白质序列仪进行测定。蛋白质测序仪的出现使得蛋白质测序工作有了很大的发展。它不仅能大大缩短测定周期,还能减少样品的用量，提高了分析精度和准确性，是一种最佳最常用的蛋白质超微分析方法。1950年，Sanger采用2,4-二硝基氟苯(DFNB)法，花费十年的时间，消耗100多克胰岛素样品，通过手工测定，完成了胰岛素51个氨基酸序列的测定。这是人们首次完成的蛋白质一级结构测定。1967年,PehrEdman和Begg设计了第一台蛋白质自动测序仪，从此开始了用仪器测定蛋白质序列的新纪元。1970年测定一个蛋白样品需要耗时一年左右,耗蛋白样品大约1g。1980年测定一个蛋白样品需要耗时一周左右,耗蛋白样品大约1mg。1985年通过蛋白质序列仪已经测定出两千多个蛋白样的氨基酸序列。1995年测定一个蛋白样品质需要用几小时到十几小时,样品用量降至μg-ng级水平。1.2蛋白质序列测定的重要意义蛋白质序列测定主要可以提供以下几种参数:(1)为DNA序列分析找出探针，(2)作为蛋白质和肽类纯度鉴定(3)研究蛋白质的结构及功能之间的关系及蛋白质结构的同源性。(4)确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点(5)确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点(5)可以科学的解释蛋白质晶体结构,蛋白质分子进化的分支点,分子遗传疾病发病机理，分子免疫的机理。1.3N—末端氨基酸测序的优点:(1)氨基酸测序测定自动化程度高，省时、省力、准确性高(2)灵敏度高，样品用量可达pmol水平(3)测定的肽链较长，可以连续测定30-50个残基(产率90-98%)(4)测定速度快，测定周期短,一天可以测1-2种样品2基本原理2.1.Edman降解法蛋白质N—末端氨基酸序列测定核心是Edman降解法。它是将蛋白质一级结构中氨基酸从蛋白质的N—末端逐个地降解下来,并把它转化成为性质比较稳定的PTH氨基酸。从蛋白质N—末端氨基酸降解下来到获得稳定的PTH氨基酸的过程，称为Edman降解。Edman降解法的基本原理是异硫氰酸苯酯能在较温和的条件下与具有自由氨基的多肽或蛋白质发生偶联反应,生成苯氨基甲硫酰衍生物,后者经过环化，并从肽链上断裂下来，然后转变为PTH氨基酸，完成一次Edman降解。去掉一个氨基酸的肽链或蛋白质有重新与异硫氰酸苯酯发生偶联反应，再重复上面的步骤。Edman降解如此反复进行。每一次切下来的PTH-氨基酸通过内置的高效液相层析分离系统，分析鉴定每一个氨基。按每次切下来单个氨基酸先后顺序拼接起来就可以获得整个蛋白质或肽的一级结构。测序过程中Edman降解反应，主要分为三个步骤。2.1.1偶联反应在三甲胺维持的碱性条件下,待测蛋白质或肽分子的α—氨基与异硫氰酸苯酯(PITC)发生偶联反应,生成苯氨基甲酰蛋白质（亦称苯乙内酰硫脲蛋白质,PITC—蛋白质），反应式如下：PITC与蛋白质偶联反应的过程2.1.2断裂获得的PTC—蛋白质在无水三氟乙酸(TFA)的作用下,水解断裂下一个苯氨基噻唑啉酮氨基酸(称ATZ—氨基酸),反应式如下:PTC-蛋白质复合物裂解反应过程2.1.3转化获得的ATZ—氨基酸非常不稳定，在10%三氟乙酸水溶液中转化为较稳定的PTH-氨基酸，反应式如下:ATZ-氨基酸转化成PTH-氨基酸的反应过程在Edman降解过程中，虽然在断裂和转化反应过程中都是在TFA的条件下进行化学反应,但这两步反应必须分别进行。因为断裂反应是在无水三氟乙酸下进行的,而转化反应是在10%三氟乙酸水溶液中进行的。若两步合为一步反应，使用无水三氟乙酸的反应条件，ATZ-氨基酸不会转化为PTH-氨基酸，采用10%三氟乙酸水溶液的反应条件会使蛋白质的部分肽键分解。所以反应的条件不一样得到的反应产物不同。2.2PTH-氨基酸的鉴定:经转化的PTH-氨基酸,经过序列仪中内置的高效液相层析或高效薄层层析系统分离鉴定，由于每一种氨基酸在高效液相层析中的保留值不同。将每次得到的PTH-氨基酸在高效液相层析中测得的保留值与标准PTH—氨基酸的保留值进行比较，便可确定是何种氨基酸。在测序之前要制作一个标准PTH—氨基酸图谱。(1)高效薄层层析分析法:将PTH-氨基酸,通过高效薄层层析(如聚酰胺薄膜层析)分离,每一种PTH—氨基酸在一定的展层剂的条件下，其迁移率是一定的，在薄膜上的坐标的位置就可以确定。然后与标准的PTH—氨基酸在薄膜上的坐标的位置比较,便可知蛋白质N末端切下来的氨基酸。PTH—氨基酸在268nm处有较强的吸收.用紫外光照射,即可在荧光屏上看到,通过电脑自动识别相对位置,即可确定。(2)高效液相层析法将PTH-氨基酸通过高效液相层析C18柱进行分离,每一种PTH—氨基酸的疏水性有差异，它们在高效液相层析时的保留值不同，根据每次得到的单个PTH—氨基酸在高效液相层析的保留值与标准PTH—氨基酸的保留值比较，便可确定是哪一种氨基酸。图3肌红蛋白部分肽链的氨基酸图谱3蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪蛋白质N-末端氨基酸测定序列仪，简称蛋白质序列仪。仪器的结构是非常复杂的，主要分三大部分，即供气系统、主机和计算机。供气系统包括惰性气体储气瓶，电磁阀，气路管等，主机包括自动进样系统，化学反应系统，氨基酸自动分析系统，计算机主要控制测序过程和报告结果。基本结果如图4所示。目前能够生产蛋白质序列仪的公司很多,如:Beckman，PerkinElmer，Shimadzu(岛津)，Waters，Socosi，Illitron，Pharmacia，ABI等等。每个公司有自己的特点，仪器的技术指标略有差异。但是测定的基本原理是相似的。根据仪器的基本结构和分析方法，蛋白质序列仪大致可以分为四类。液相蛋白质序列仪固相蛋白质序列仪气相蛋白质序列仪脉冲式液相蛋白质序列仪各类以从最初推出的型号到现在都做了不同程度的改进。每次改进使仪器的灵敏度都有一定的提高，测定需要的样品量有所下降，连续测定蛋白质链的长度有所增加，每测定一个氨基酸所用的时间有所缩短。现将这几种仪器的基本构造和测定方法简单介绍一下：3.1液相蛋白质序列仪液相蛋白质序列仪根据Edman降解原理自动旋转杯式测定法而建立的，所以也称之为旋转杯蛋白质序列仪。如Beckman公司在1969年生产的890型蛋白质序列仪,是最早推出的一种型号。随后又先后推出了890C,890M.型.每次测定的样品用量从最初的250nmol到二十世纪九十年代只需几十pmol左右。仪器工作的基本原理主要经过以下几步：(1)将待测的蛋白质加入到仪器的旋转杯中。(2)在一定的条件下进行Edman降解,经偶联－裂解－获得ATZ氨基酸。(3)旋转杯一边旋转，一边抽真空，除去Edman降解时残留的溶剂后,降解的蛋白质和从蛋白质N末端断裂下来的ATZ—氨基酸形成薄膜,贴在旋转杯内壁上。(4)从蛋白质N—末端断裂下来的ATZ—氨基酸经氯丁烷抽提出来。(5)高效液相层析分离鉴定。除去氯丁烷，将ATZ—氨基酸转化成PTH—氨基，通过高效液相层析进行分析(6)N—末端氨基酸确定：将从蛋白质N—末端断裂下来的PTH—氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N—末端氨基酸。优点：操作简单，每一个氨基酸残基需要60分钟。缺点：对小分子肽及疏水性较强的肽容易在氯丁烷抽提过程中损失。3.2固相蛋白质序列仪固相蛋白质序列仪是在1971年由Laursen首先设计出来的仪器，这类仪器主要有SocosiPS-300型，Pharmacia-LKB4020型,Sequemat12型等等。仪器工作的基本原理主要是用聚乙烯等固相支持物将待测蛋白质羧基端(C-端)偶联在层析柱上,然后进行Edman降解和PTH-氨基酸的鉴定。仪器工作的基本原理主要经过以下几步(1)待测蛋白固定：通过化学方法将蛋白质C—端羧基偶联固定在层析柱上(2)Edman降解：经过偶联－裂解－获得ATZ—氨基酸(3)洗脱：将经Edman降解获得ATZ—氨基酸用有机溶剂(如氯丁烷等)从柱上洗脱下来(4)蒸发：含有ATZ-氨基酸有机溶剂蒸发除去，得到ATZ-氨基酸(5)高效薄层层析分离鉴定：将ATZ—氨基酸转化成PTH—氨基酸,通过薄层层析分离(6)N末端氨基酸确定：将从蛋白质N—末端断裂下来的PT—氨基在高效薄层层析的图谱与标准氨基酸的图谱比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N—末端氨基酸。优点：防止小分子肽或疏水性较强的肽在有机溶剂萃取过程中丢失，使用试剂的纯度要求相对不十分高。缺点：蛋白质中的Glu,因-羧基结合在载体上,使之无法检测到,Asp也会妨碍进一步降解反应3.3气相蛋白质序列仪气相蛋白质序列仪是在1978年由HunkapillerM.W.和HoodL.E.等人设计的一种仪器,利用polybrene作为蛋白质的载体,高效液相层析为分离系统。1980年由美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems,ABI)推出了470A型气相蛋白质序列仪。该仪器的基本工作原理是通过高纯的三氯乙酸气体,在反应器滤膜上进行降解,然后检测PTH-氨基酸。主要分以下几步完成。(1)加样：将待测蛋白溶液加在反应器滤膜上,该反应器是由两个光滑玻璃柱空隙组成,体积为160l(2)Edman降解：蛋白质与PITC反应后,由纯的TFA气体降解－获得ATZ—氨基酸(3)抽提：切下的氨基酸残基经氯丁烷抽提,转移至容积为1ml的转化器中(4)转化：ATZ—氨基在TFA的作用下转化为PTH-氨基酸(5)高效液相层析分离鉴定：PTH—氨基酸被输送到氨基酸分析仪中,采用HPLC反相层析法分离(6)N末端氨基酸确定：将从蛋白质N—末端断裂下来的PTH—氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N—末端氨基酸。优点：试剂与溶剂都是通过氩气输送,由阀门自动控制，可以避免试剂之间的相互污染；反应在恒温器中进行,保证了最佳反应条件,重复性好；反应步骤分别在反应器或转化器中进行,提高了反应效率；样品用量少，回收率高缺点：试剂纯度要求很高3.4脉冲式液相蛋白质序列仪脉冲式液相蛋白质序列仪是美国应用生物系统公司在1986年推出的一种蛋白质序列仪,该仪器吸取了气相蛋白质序列以的优点，克服了其不足。仪器的基本结构与气相蛋白质序列仪相似，主要分为反应器、转化器和高效液相分离系统等及部分。主要分以下几步完成。(1)加样：将待测蛋白溶液加在反应器滤膜上,该反应器是由两个光滑玻璃柱空隙组成,体积为160l(2)Edman降解：蛋白质与PITC反应后,通过高纯的液态TFA降解，获得ATZ—氨基酸(3)氯丁烷抽提：降解下来下的氨基酸残基经氯丁烷抽提,转移至容积为1ml的转化器中(4)转化：ATZ—氨基在10%TFA的作用下转化为PTH—氨基酸(5)高效液相层析分离鉴定：PTH—氨基酸被输送到氨基酸分析仪中,采用HPLC反相层析法分离(6)N末端氨基酸确定：将从蛋白质N—末端断裂下来的PTH—氨基在高效液相层析的保留值与标准氨基酸的保留值比较，便可确定是什麽氨基酸。该氨基酸就是蛋白质的N—末端氨基酸。脉冲式液相蛋白质序列仪与气相蛋白质序列仪的区别有以下几点：(1)通过液相输送TFA及三甲胺，使供应试剂更为精确，更容易控制。(2)在测定过程中可以随时改变反