PBMC

PBMC最新研究进展汇报人：郭艳菊日期：1月7日1.PBMC的提取方法2.PBMC在单细胞测序的文献搜索1、提取方法外周血中提取人淋巴细胞（PBMC）的方法主要有：Ficoll密度梯度离心法，percoll分层液法。（1）percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒，利用percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒。（2）Ficoll密度梯度离心法：利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分层液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，常用来分离外周血单核细胞。密度梯度离心法分离PBMC1.在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll。2.取抗凝静脉血与无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。3.水平离心400g×30分钟。4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。PBMC分离图片密度梯度离心法分离PBMC5.去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。6.末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。7.加入10mLPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。8.末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。2、PBMC在单细胞测序方面的文献（1）各种单细胞测序技术的应用（2）生物标志物10xGenomicssinglecellRNA-seq单细胞测序技术Distinctpopulationscanbedetectedinfresh68kPBMCs.GraceX.Y.Zheng.etc.NatureCommunication,2017.预测生物标志物方法：利用多维的质谱流式技术对黑色素瘤病人治疗前、手术12周后和年龄性别匹配的健康人群样本(n=20，共60个样本)中的外周血单核细胞(PBMC)进行检测。结果：发现病人外周血中具有CD14+、CD16−、HLA-DRhi表型的经典单核细胞(classicalmonocytes)比例可以作为衡量病人是否适宜接受抗PD-1/PD-L1免疫治疗的指标。(1)不同细胞表型的淋巴细胞(2)T细胞功能(3)髓细胞亚群进行深度分类分析病人外周血中具有CD14+、CD16−、HLA-DRhi表型的经典单核细胞(classicalmonocytes)比例可以作为衡量病人是否适宜接受抗PD-1/PD-L1免疫治疗的指标。预测生物标志物方法：采用病毒包容性单细胞RNA-seq方法(viscRNA-Seq)，对6名登革热患者和4名健康对照患者在疾病早期获得的数千个单个PBMCs转录组进行了分析。结果：发现了细胞类型特异性免疫激活和候选的预测生物标志物，还确定了病毒与特定细胞群的优先相关性，特别是初始B细胞和单核细胞。Fig：FACS-assistedviscRNA-SeqworkflowonPBMCsfromDENV-infectedandhealthycontrolhumansubjects.3、总结（1）大部分只做了单独的PBMC的淋巴细胞亚群，并没有把组织和PBMC做对比。（2）High-dimensionalsingle-cellanalysispredictsresponsetoanti-PD-1immunotherapy这篇文献中，有关抗PD-1治疗，术前术后的淋巴细胞亚群变化的聚类分析可以用来参考做食管鳞癌病人组织和外周血的聚类分析，研究食管鳞癌术前术后的细胞亚群变化。