folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度

-1-实验题目福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一【实验目的】1．学会使用福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度。二【实验原理】蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定三【实验仪器】1.卵清蛋白片2.7220分光光度计3.试管4.移液管四【实验试剂】1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，-2-用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml五【试验步骤】1.标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。OD500摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色0.50.50.50.50.50.50.50.5Folin-酚试剂B摇匀，在室温下放置10分钟0.5（样液）04.00.504.00.40.14.00.30.24.00.20.34.00.10.44.00.050.454.000.54.0牛血清蛋白液(1mg/ml)ml蒸馏水mlFolin-酚试剂A样品7654321管号六【实验现象及结果计算】最后测得的实验数据如图-3-根据表格绘制图像如下标准曲线y=1.1101x+0.0233R2=0.985500.10.20.30.40.50.60.700.20.40.6蛋白液浓度mg/ml吸光度值系列1线性(系列1)线性(系列1)样品吸光度y=0.297，则计算得到样品蛋白液的浓度为x=0.30408mg/ml所以待测蛋白液样品的浓度为3.0408mg/ml七【实验分析】一实验注意1一定要注意实验所需要的时间，因为溶液的光密度值随时间会发生-4-变化的。不然的话会导致实验误差。2在使用分光光度计的时候要拿比色皿的毛面。3实验前应把试管洗干净并烤干，以使实验的准确性增加。若有水残留则会使标准液浓度偏低，继而使测得的样液浓度偏高二误差来源分析:1显色时间控制存在误差，各个样品的比色时间也无法完全一致。2取用蛋白质溶液可能存在不完全均匀的情况，对结果造成影响。3试管可能未完全干燥，使标准液浓度不准确。