动物转基因技术的发展(综述)

动物转基因技术的发展（综述）姓名:xxx学号：xxx摘要：本文介绍了转基因及转基因技术的概念，详述了转基因动物的发展历程、现状及其发展趋势；通过列举重点分析了转基因技术手段与转基因检测方法，并且比较各种方法之间的差异。呼吁人们辩证的看待转基因食品，正确认识转基因技术并且包容的看待转基因的发展。关键词：发展史，转基因手段，检测手段，优缺点，伦理问题，法律监管引言：转基因技术不仅是21世纪生物技术发展的热点，也是舆论声音最多的话题。如今动、植物的转基因食品逐渐步入人们的日常生活，它正潜移默化的改变着我们的饮食习惯和结构。认识它们、了解它们，会使我们对社会谣传的各种转基因的舆论有一个辩证、清晰的认识。转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一，它的发展标志着人类科学的巨大进步。但是，面对转基因技术暴露的生态、环境问题，生物多样化问题以及基因漂移等问题，我们也要正视。使转基因技术造福人类才是我们的最终目标。一、动物转基因技术发展史从20世纪70年代中期开始，人们开始尝试用各种办法像动物体内转移外源基因。1975年Gordon等人用爪蟾的分化细胞进行核移植得到了蝌蚪，证实了两栖动物部分分化的细胞具有发育的全能性，细胞分化后基因组的改变是可逆的，基因组中存在重新启动发育所需要的所有基因。该理论为哺乳动物体细胞核移植技术的研究奠定了理论基础。80年代后，动物转基因技术中展较快的一种方法是：从目的供体物种体内获得带有特定优良遗传性状的DNA片段，即目的基因，直接或通过载体导入被改造物种即“受体物种”的胚胎内，培养出优良的新品种。Gordon首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因(RGH)导入小鼠的受精卵,得到转基因小鼠的成年体重是对照的2倍,被称为超级小鼠。1997年,Wilmut等用来自胎儿的成纤维细胞和成年绵羊的乳腺上皮细胞进行核移植,得到了3只来自胎儿成纤维细胞的核移植绵羊和1只来自成年绵羊体细胞的核移植绵羊多利,首次证明了成年动物的分化细胞具有发育的全能性,可以维持核移植胚胎发育到出生。体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功,证明了高度分化的动物细胞具有全能性。21世纪以来，动物转基因技术已经有了长足的发展。目前，生长速率快、抗病力强、肉质好的转基因兔、猪、鸡已经问世。梁利群等克隆子大马哈鱼的生长素基因，在体外经过和鲤鱼的MT启动子基因重组，导入黑龙江野鲤，选育出了超级鲤。近期，有人将疫苗的基因转移入羊的乳腺，使这些产物随乳汁而分泌，比用工程菌生产的成本更低、产量更大。1997年9月上海医学遗传研究所与复旦大学合作的转基因羊的乳汁中含有人的凝血因子。这是人类通过动物转基因，廉价、大量生产珍贵药物的重要突破。二、动物转基因食品详述1、转基因、转基因食品概念首先，转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术。而转基因食品（GeneticallyModifiedFoods，GMF）则是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品、原料，加工生产的食品就是“转基因食品”。我们可以根据转基因食品的来源，分为：植物性转基因食品，动物性转基因食品，微生物转基因食品。本文主要介绍的是转基因植物和转基因动物。2、动物转基因食品种类目前，人类能够获得的转基因动物有：超级鲤，超级鼠，鸡，山羊，猪，绵羊，牛，蛙等。通过转基因技术，我们能使某些动物体型更大；能提高动物的产仔数、产奶量；能增加猪肉的瘦肉量，提高口感；能提高动物皮毛品质与加工性能；能提高动物的抗寄生虫能力；能增加蛋白质的种类，提高营养；能提高动物的抗病性；能培育出产生人体分泌物的动物。3、动物转基因主要运用手段（1）传统方法传统的哺乳类动物基因转移方法，是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前的胚胎细胞），然后将此受精卵（或着床前的胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。根据外源基因导入的方法和对象的不同，目前制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、精子载体导入法等。显微注射是最常用且成功率较高的方法。接下来分别介绍以上方法。1）显微注射法：显微注射法又称DNA显微注射法，是指用显微操作仪将外源基因直接主入手蹄动物的受精卵中，是外源基因整合到受精卵的基因组中，最终发育成转基因动物的技术。显微注射法最早由美国人Gordon发明，Palmiter成功用此方法研制出了超级小鼠，此后转基因兔、转基因绵阳、转基因山羊随即问世。显微注射法是目前动物转基因生产中应用最广泛、最有效的方法之一。2）反转录病毒法：它是利用逆转录病毒的长末端重复序列（LTR）区域具有启动子活性的特点，将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后，制成高滴度的病毒颗粒，认人为感染着床前或着床后的胚胎，也可让胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育已达到感染目的。逆转录病毒RNA进入宿主细胞后，被反转录为DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下，整合到宿主细胞的基因组，进行表达和遗传，得到转基因动物。例如嵌合鸡的制作。3）精子载体法：精子载体法是指将外源基因与精子共同培养，或者过电穿孔、脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的镜子，使精子携带外源DNA进入卵细胞受精，得到整合有外源DNA的受精卵，然后经胚胎移植将转基因受精卵转移到同期发情的动物子宫内，经胚胎发育产生转基因动物。例如，1989年制成的转基因阳性鼠。4）体细胞核移植法：此方法首先要将目标基因转移到体外培育的动物细胞中，筛选出阳性转基因细胞并进行繁殖，制备出供移植用的细胞核供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中，重构胚胎经过激活和培养后，移植到代孕动物中，从而产生转基因动物。比如最著名的克隆羊多莉，表达人凝血因子的转基因绵阳等。四种方法各有千秋，也各自暴露出各自的缺陷。下面表格是四中传统方法的特点的比较。（2）最新方法近几年来。又有三种转基因的方法流行开来，一个是性腺转基因法，一个是RNAi转基因法，还有一个是基因打靶技术。1）性腺转基因法：应用各种手段，将外源基因转染原始生殖细胞后，或将外源基因或其载体直接侏儒生殖细胞内，使其整合入生殖细胞基因组中，再通过有性生殖产生转基因动物。最著名的例子是Kim等人把外源基因用脂质体转染精原细胞，再将被转染的精原细胞注射到精原细胞被破坏的雄性动物睾丸的曲精细管内，发现小鼠康复后，可以产生携带外源基因的精子，这只雄鼠与雌鼠交配后，成功获得表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。性腺转基因法操作简单，技术要求低，难度小。缺点是，外源基因随机整合方法比较特点显微注射法外源基因的导入整合效率较高，不需载体，实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。反转录病毒法该法整合率较高，操作简单，但是表达率低。目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。基因导入受体细胞的过程，有可能激活原癌基因或者其他有害基因。得到的转基因家禽多为嵌合体，需要广泛杂交，以建立转基因系。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。精子载体导入法该法简单、方便，不需要昂贵的显微操作以及设施。动物育种不经过嵌合体，周期缩短，依靠生理受带过程，免去了对原核的损伤，整合率高。但在实践中成功率较低，结果不稳定，重复性差。体细胞核移植法最突出的优点是可以减少受体动物的数目，不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎。因为该方法事先对阳性细胞进行筛选，简化了环节。转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致，不需要选配就可以建立转基因群体。它的不足之处在于，费用高，效率低，制成的部分个体表现生理或免疫缺陷。而且对设备和技术要求很高。进入宿主基因组，难以实现定点整合。2）RNAi转基因法：RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默机制（PTGS），它通过一段双链siRNA或者单链miRNA导致同源mRNA降解，从而阻断目的基因的表达。RNAi是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。1990年才开始走入科学家的视野，2002年，MasaruOkabe实验室成功建立了第一种应用RNAi机制得到转基因小鼠的实验。RNAi可以作为一种有效的工具来产生转录后基因沉默的效果，从而抑制特定基因的表达，这种方法已在线虫、果蝇、老鼠等模式生物中得到成功应用。但是，由于RNAi机制至今仍未解释清楚，很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果。而且，此方法只是在转录水平上降低基因表达，不能像基因敲除那样100%的吧基因从基因组中剔除干净。3）基因打靶法：基因打靶技术是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞技术按定向组合的方式改变生物遗传信息的实验技术。它通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上。例如，Thomas等首先对小鼠胚胎干细胞进行了基因打靶，然后将此打靶的胚胎干细胞移植进入小鼠囊胚，将此重组胚移植进入代孕母鼠，最后产出嵌合体仔鼠，通过遗传育种获得基因敲除的纯合鼠。基因打靶技术可以精细的修饰和改造基因的DNA片段，具有位点专一性强和打靶后目的片段可以和染色体DNA共同稳定遗传的特性。基因打靶技术克服了随机整合的盲目性和偶然性，整合位点精确，表达水平高。但是，它的打靶及检测效率低；能自发进行二次同源重组。4、动物转基因的检测方法转基因动物的检测可以从转基因的水平分类：转录水平，翻译水平，转基因动物整体表型的水平。各个分类下的主要检测方法已在下面表格列出。检测水平检测方法染色体和基因水平DNA斑点杂交法，PCR技术,Southern印迹法，染色体原位杂交，整合拷贝数的检测转录水平Northern印迹法，RT-PCR，引物延伸分析，RNase保护分析，RNaseSl保护分析法基于以上分类，每种检测水平下，又有几种主要的检测手段。下表选出了动物转基因中重要的几种检测方式进行描述。这些方法的实施过程如下表。翻译水平免疫荧光抗体法检测表达蛋白，免疫沉淀法检测表达蛋白，Western印迹分析检测表达蛋白质，免疫酶标法(ELISA分析），生物化学性质和生物学活性分析转基因动物整体表型的水平通过动物整体水平上观察表现型的改变,分析基因型对动物整体性状和生理功能的影响,来进一步鉴定基因的性质。检测水平分类主要检测手段检测方法描述染色体和基因水平DNA斑点杂交法通过直接将变性的待测DNA样品点在尼龙膜(或硝酸纤维素膜)等固体支持物上,然后和探针杂交,从而检测样品中是否存在目的DNA序列。PCR技术在基因模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，在短时内可将模板DNA扩增至百万倍下检测。Southern印迹法通过探针和已结合于硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上的经酶切、电泳分离的变性DNA链杂交,检测样品中是否存在目的DNA序列的方法。转录水平Northern印迹法该方法是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜上的RNA分子杂交,检测样品中是否存在目的RNA序列。RT-PCR以总RNA或mRNA为模板,逆转录合成cDNA的第一条链,经这条链为模板,在有一对特异引物存在的情况下进行PCR检测转基因是否表达,还可进行定量分析。RNase保护分析在RNA探针和靶RNA分子杂交时,如果二者的同源性不同,则形成杂交体的结构不同，用RNase处理杂交体时完全互补的杂交体不被RNase水解(被保护),而未杂交的单链和杂交体中的单链环则被水解。翻译水平免疫荧光抗体法检测表达蛋白此方法利用待检细胞株先后与第一抗体、第二抗体反应,再用荧光显微镜观察照相即可。免疫酶标法(EL