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柠檬酸摇瓶发酵及提取生技08-2班L3eMon小组廖维华刘露刘豫宁麻佳佳实验目的：1、学习掌握柠檬酸液体发酵工艺2、了解柠檬酸提取工艺3、增强团队协作能力柠檬酸：C6H8O7物化性质：白色结晶粉末，无臭。熔点(℃),153℃。味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78℃时一水合物会分解得到无水合物。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。所以，柠檬酸提取过程中，温度控制很重要。分子式：实验原理高度亲水性实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌（黑曲霉菌）而言，在实验pH下，其顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸。•柠檬酸的发酵的过程80%的糖代谢走EMP途径黑曲霉中存在TCA的酶系•柠檬酸发酵的条件1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH接近中性时则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低；3、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速200r/min）。生产菌种：黑曲霉Aspergillusniger半知菌亚门，丝胞纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属。真菌中的一个常见种。生长适温37℃，最低相对湿度为88%柠檬酸产量最高的菌种。且能利用多样化的碳源。生产方法：深层液体发酵法发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化实验流程斜面发酵培养基接种补糖4d,28℃提取（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）（摇床）（每48h补一次）2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3CO2↑+H2O中和终点pH:6.0～6.8温度：50～70℃菌液过滤中和酸解过滤脱色去金属离子浓缩结晶Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O，85℃在此温度下各种变体石膏的溶解度均最小），并有利于形成片状的半水石膏，便于过滤加热至80～90℃加热的作用：终止发酵；使蛋白变性凝固，降低发酵液黏度；使菌体中的柠檬酸释放活性炭，1～3%，85℃，搅拌30min强酸型阳离子交换树脂50～60℃，常压浓缩易分解成乌头酸，且结晶色泽变深提取工艺流程1、菌种：黑曲霉Aspergillusniger2、培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基,发酵培养基(土豆200g煮汁、蔗糖20g、NH4NO32g，KCl0.15g，MgSO40.25g，水1000ml；pH=5)3、器材：三角瓶2个，棉塞2个，纱布若干，接种环，小烧杯，水浴加热锅，离心机，离心管，PH试纸，电子天平，滤纸，大试管,电炉（加石棉网）,摇床,玻璃棒，无菌tip头，移液枪，碱式滴定管，电子显微镜4、试剂：无菌水，酚酞，0.1429～0.1430mol/LNaOH溶液，CaCO3，10%H2SO4，40%蔗糖溶液实验器材实验步骤2、发酵培养基配制及分装（以实验室为单位）配方：土豆200g煮汁、蔗糖20g、NH4NO32g，KCl0.15g，MgSO40.25g，水1000ml；pH5（总糖100g/L；基础20g/L+补糖80g/L）分装：每小组2瓶，每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min3、制备孢子悬液及接种（以小组为单位）向每支斜面菌种加入5ml无菌水，用接种环刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬液；将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基。注：勿接入过多孢子，否则菌丝过于浓密，影响产酸和后处理中的过滤4、摇瓶发酵、补料及参数检测摇瓶条件：200rpm，32℃；发酵4天补料：发酵48h补糖，每瓶（100ml）加入灭菌40%蔗糖液27ml。参数检测：接种后每24h取样测定、记录发酵液pH。5、发酵液酸度测定酸度—是指100ml发酵液所含柠檬酸的克数。酸度测定方法：取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.1429～0.1430mol/L标准NaOH溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度。（通过对柠檬酸酸度的测定，可以推出从葡萄糖到柠檬酸的转换率。）6、柠檬酸提取（部分）1）2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3CO2↑+H2O2）Ca3(C6H5O7)2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O3）浓缩结晶C6H8O7·H2O分子量210.14CaCO3分子量100.1Ca3(C6H5O7)2·4H2O分子量570.50硫酸分子量98，比重1.841g柠檬酸↓0.714g碳酸钙↓1.357g柠檬酸钙↓0.7g浓硫酸=0.38ml浓硫酸=3.8ml10%硫酸柠檬酸的产量可以根据酸度值算出中和酸解菌丝过滤发酵液经2～4层纱布过滤（如需要可再用滤纸过滤一次）或经离心（菌丝球很小的过滤太慢）取滤液；测量滤液体积；将发酵液倒于小烧杯，置70℃水浴加热。中和根据酸度测定结果计算出滤液中所含柠檬酸克数，并计算出与柠檬酸反应所需的CaCO3的量；称取CaCO3，慢慢将CaCO3加入发酵液中，轻轻摇动烧杯，反应至不再有气泡产生，pH6.0～6.5。用滤纸过滤，得白色柠檬酸钙；柠檬酸钙结晶呈成簇的针状。如果发现所得结晶有杂色（如发黄），可将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯，加适量水，洗后再次过滤。酸解将柠檬酸钙结晶从滤纸上刮至小烧杯，加适量水调成“糊”，将小烧杯放85℃水浴中加热。根据计算，向小烧杯中慢慢加入所需10%H2SO4，边加边轻轻摇动烧杯，使反应进行彻底。过滤，将滤液收集到大试管（过滤时可将试管插在试管架上），滤液即为柠檬酸溶液，用于下一步浓缩结晶。滤纸上的白色物为硫酸钙结晶，显微镜下呈片状或针状。浓缩与结晶将大试管中的柠檬酸液倒入小烧杯，置电炉（加石棉网）上加热，煮沸浓缩。待观察到浓缩液中有少许白色晶体出现（此时已为过饱和，浓缩液易向外喷溅），即可停止加热，令浓缩液冷却；在冷却过程中，柠檬酸逐渐从浓缩液中结晶析出。滤纸过滤，得柠檬酸结晶；柠檬酸结晶显微镜下呈针状。准备1、发酵培养基2、补料用40%蔗糖溶液配制200ml，分装于2个250ml三角瓶3、标定用NaOH标准溶液配制200ml，装蓝盖瓶4、酚酞指示剂0.1g溶于250ml70%～90%酒精，装蓝盖瓶计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸发酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O实验结果1、观察孢子萌发、菌丝球的生长情况（进行拍照）2、接种后每24h取样测定、记录发酵液pH值3、发酵4天后取样测定酸度（计算后面要用的CaCO3以及H2SO4用量）4、中和后照下柠檬酸钙照片，酸解后照下硫酸钙照片5、浓缩结晶后照下柠檬酸钙照片6、通过柠檬酸酸度计算柠檬酸发酵转化率实验分工时间内容分工第一天发酵培养基制作、灭菌、接种全体组员第二天观察菌悬液生长情况、pH值测定记录廖维华、刘露第三天观察菌悬液生长情况、pH值测定记录、补糖麻佳佳、刘豫宁第四天观察菌悬液生长情况、pH值测定记录麻佳佳、刘豫宁第五天提取、测定、拍照全体人员