研究生入学考试专业课现代分子生物学-3

研究生入学考试专业课现代分子生物学-3(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、论述题(总题数：28，分数：100.00)1.试述基因克隆载体进化过程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：自Coben等(1973)构建第一个质粒载体pSC101作克隆载体以来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的克隆载体相继出现，克隆载体的发展划分为三个阶段：第一阶段以质粒(plasmid)、λ噬菌体(λbacteriophage)、柯斯质粒(cosmid，又称粘粒)为主，主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高，但是克隆容量有限，一般小于45kb；第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量，显著特点是载体的容载能力扩大，为100～350kb，主要有酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)以及源于噬菌体P1的人工染色体(PAC)；第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染色体(BIBAC)和可转化人工染色体(TAC)，这些载体不仅具有较大的克隆容量，而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。这些载体的发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究。2.试述PCR扩增的原理和过程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。其基本原理是：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。3.说说荧光染料SYBRGreenⅠ和TaqMan荧光探针的主要不同点。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：(1)TaqMan荧光探针(2种荧光，短波长和长波长)：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。(2)SYBR荧光染料(1种荧光)：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。4.说出基因组DNA文库和cDNA文库的主要区别。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：基因组DNA文库和cDNA文库的建库过程不同，产生的基因结构也不同，因此应用范围也不相同。主要表现在：(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cDNA文库克隆的是被转录DNA序列；(3)基因组文库中的编码基因是含有内含子和外显子，而cDNA克隆的基因不含内含子；(4)基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定，cDNA文库可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。5.cDNA合成时的方向性是如何实现的?（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：在cDNA合成过程中，选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，在cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列，可以保证所获得双链cDNA的方向性。6.试述不对称交错多聚酶链式反应(TAIL-PCR)的主要技术和原理?（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：TAIL-PCR的基本原理：以基因组DNA为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计3个较高退火温度的嵌套特异性引物(specialprime，SP)和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime，AD)相组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。TAIL-PCR一般分为3次反应：①第一次PCR反应是TAIL-PCR的重要环节，由5次高严谨循环、1次低严谨循环、15次热不对称的大循环构成。通过5次高严谨循环使SP1与已知的序列退火并延伸，提高目标序列的浓度；1次低严谨循环使简并引物结合到较多的目标序列上，随后进行15次TAIL循环。经过上述循环得到不同浓度的3种类型的产物：特异性序列(两端分别拥有SP1和AD)、非特异性序列Ⅰ(只有SP1，没有AD)和非特异性序列Ⅱ(两端均为AD)②第二次PCR反应：将第一次反应的产物稀释1000倍作为模板，以SP2和AD为引物，进行12个TAIL-PCR循环，特异性序列被选择性地扩增，而非特异性序列被压制到极低的含量。③第三次PCR反应：将第二次反应的产物稀释1000倍作为模板，以SP3和AD为引物，通过15次热不对称的大循环可以得到较高含量的与已知序列邻近的目标序列。7.在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质相对分子质量的方法?（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：凝胶电泳技术、双向电泳技术、质谱分析技术等方法都可用来检测核酸和蛋白质相对分子质量的方法。(1)凝胶电泳技术。将某种蛋白质或核酸分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动，其迁移率与电场强度和该分子本身所携带的净电荷数成正比，由于凝胶为无反应活性的稳定的支持介质，故迁移率与分子的摩擦系数成反比(相对分子质量大小、极性、介质的粘度系数等)。(2)双向电泳技术。双向电泳技术是分离混合蛋白质最常用的方法。该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的，运用等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。(3)质谱分析技术。质谱分析技术是一种超灵敏的鉴定技术，常用的MALDI-TOF的工作原理是将从2-D胶中分离得到的或其他来源的蛋白质酶解成小肽段后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去。离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，这些气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的分子质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定。8.说说用polyATtract分离mRNA的主要过程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：polyATtractmRNA分离系统将生物素标记的寡(dT)引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物索蛋白以结合polyAmRNA，通过磁场吸附作用将poly(A)mRNA从总RNA中分离。9.说说cDNA差示分析法的原理和主要实验流程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：基本原理：该法充分发挥了PCR技术以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。试验对象和供试探针经4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群然后通过PCR和杂交等步骤获得差异表达的基因。主要实验流程：将含目的基因的试验对象(Tester，T)与不含目的基因的供试探针(Driver，D)分别用4碱基切割酶处理，得到平均长度为256bp的代表群，加12/24碱基接头，补平末端，以24碱基的互补序列为引物进行PCR，T改换新接头，D不加接头，将T与D按1:100杂交，设计新接头引物，通过PCR，指数扩增产物差异产物。10.说说Gateway大规模克隆技术原理及基本操作流程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：基本原理：利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，通过整合与切除反应，实现基因快速克隆和载体间平行转移。Gateway大规模克隆技术包括TOPO反应和LR反应两步。基本操作流程：TOP0反应将目的基因PCR产物连入Entry载体，载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。LR反应将目的片段从Entry载体中重组入表达载体，Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。11.说说基因图位克隆法的原理和过程。（分数：3.00）__________________________________________________________________________________________正确答案：()解析：所有具有某种表现型的基因都可以通过基因图位克隆法克隆得到。其基本原理和过程：首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。其次通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。12.说出基因组与蛋白质组的主要差别。（分数：3.00）__________________________________________________