新型疫苗研究进展

新型疫苗研究进展（二）疫苗是用于预防和治疗传染病或某些慢性疾病的生物制品，实际生活中应用最广泛的是传统灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程，但部分存在着免疫效果不确实、非特异性反应强、保护期短等缺点，这就使得新型疫苗的出现成为必然……新型疫苗研究进展重组载体疫苗DNA疫苗、RNA复制子疫苗研究进展树突状细胞疫苗、T细胞疫苗（肿瘤疫苗、治疗性疫苗的研究进展）真菌疫苗的研究进展动脉粥样硬化疫苗、糖尿病疫苗、避孕疫苗的研究进展重组载体疫苗用减毒活病毒或减毒活细菌作为载体，将编码特定病原体免疫原性蛋白的基因插入载体，作为疫苗输入机体诱导特定免疫应答。重组活载体疫苗的优点(1)成本低廉、易于大量生产(2)比其它制剂，如亚单位疫苗具有更长的储存期及更强的稳定性(3)免疫途径简单、易于接种(4)特别适合于大规模的免疫接种等重组活菌疫苗载体分类：细菌、病毒减毒的微生物，包括Shigellaflexneri、Bacillusanthracis、、SalmonellaTyphimurium、SalmonellaTyphi、Y.pseudotuberculosis、Listeriamonocytogenes。无毒的细菌，如Lactobacillus。问题：引起免疫抑制，建立潜伏感染、毒力恢复和外源基因表达不稳定免疫原性差关键解决细菌载体的安全性、免疫原性和外源抗原基因在无抗生素选择压力下能否随宿主稳定遗传等问题乳酸菌在表达外源基因的特点：某些菌种带有大量染色体外因子，易建立新表达载体系统易培养，遗传操作方法成熟、简便、效率高，重复性好乳酸菌为食品级细菌，可有效提高基因工程产品的安全性具有活性很高且可调控的启动子系统，可表达毒素基因可在细胞内、细胞表面、展示表达或分泌到细胞外乳酸菌表达的外源蛋白不需经过纯化就可以直接服用某些菌株，如乳杆菌对机体有极强的黏附作用，其表达蛋白可源源不断地在黏膜处产生，有效引起机体的免疫应答和免疫耐受，重组病毒活载体一种是复制缺陷性载体病毒，只有通过特定转化细胞的互补作用或通过辅助病毒叠加感染才能产生传染性后代，无排毒的隐患，又可表达目的抗原另一种是具有复制能力的病毒，如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒等，它们可作为外源基因的载体而保持自身传染性目前，用作载体的病毒主要有痘病毒和腺病毒痘病毒特点基因组容量大及非必需区基因多有利于进行基因工程操作易于构建和分离重组病毒可以插入多个外源基因对插入的外源基因有较高的表达水平。痘病毒优点无致癌性、稳定性好、宿主范围广基因组容量大、非必需基因多能诱发机体产生很强的体液免疫和细胞免疫分子生物学、基因工程、生物活性物质生产、基因重组疫苗及多价疫苗研究的有效工具。举例将编码外壳蛋白的基因（比如乙型肝炎病毒的表面抗原）插入牛痘病毒的基因组则可在牛痘病毒启动子下表达。注射到血液中后，重组病毒的复制不仅导致新的牛痘病毒颗粒产生，还会产生大量的表面抗原，从而对天花和乙型肝炎病毒产生免疫力。腺病毒（adenovirus,Ad）Ad已有49个血清型。1956年，Ad4被鉴定为美军急性呼吸道疾病的病原体60年代开发Ad4和Ad7减毒口服活疫苗美国（主要是军人）已有1亿人次口服了Ad4、Ad5以及Ad7活疫苗胶囊，无曾发生不良反应报告，疫苗有效率高达99.7%人类肿瘤细胞中，尚未发现腺病毒基因的整合腺病毒容易增殖、使用方便、稳定性良好，具有广泛的免疫适应性，既可以在呼吸道增殖，也可以在消化道增殖，因此具备作为活病毒口服疫苗载体的条件。DNA疫苗、RNA复制子疫苗开发核酸疫苗是一种新型疫苗免疫策略DNA疫苗把一个或几个抗原蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，将此重组质粒转入机体内，使编码基因借助宿主的转录和翻译机制获得表达，进而通过抗原提呈细胞将抗原提呈给免疫细胞，从而激活机体的细胞和体液免疫应答。在小鼠和人体实验中，人们通过基因枪免疫途径研究编码流感病毒的不同蛋白HA、NA、M1、NP和NS1质粒，结果证明H1-DNA和N1-DNA可以诱导高水平的特异性抗体在流感病毒攻击实验中起到很好的保护作用重组腺病毒载体疫苗对NP-DNA疫苗有协同作用NP-DNA+重组腺病毒载体疫苗小鼠诱导出显著的体液免疫和细胞免疫应答并可以帮助小鼠抵抗来自异型流感病毒——高致病性亚型流感病毒的攻击。全球性流感大流行的威胁和传统疫苗的局限性使得DNA疫苗被认为是一种能够替代传统疫苗的免疫策略，DNA疫苗主要不足(1)核酸疫苗长期在体内表达，可引起机体过量免疫或产生免疫耐受现象，最终导致机体免疫抑制(2)外源基因进入机体后，可与宿主的基因发生整合，导致宿主细胞肿瘤基因活化、抑癌基因灭活或去向不明(3)持续的抗原表达所激起的强烈CTL应答可能会对机体其它细胞产生毒性杀伤作用鉴于DNA疫苗的缺陷。。。。。。RNA疫苗不会与宿主染色体DNA直接结合，可降低基因的插入突变和整合的概率，既能克服DNA疫苗可能引起细胞转化的潜在危险，也能解决DNA通过核膜的困难，限制其高效表达的缺陷。RNA替代DNA作基因疫苗。具有抗原表达效率高、安全性能良好以及应用范围广等优点RNA病毒（RNAvirus）是核酸为RNA的病毒总称艾滋病病毒、烟草花叶病毒、SARS病毒、西班牙流感病毒和甲型H1N1流感病毒等都是RNA病毒。RNA病毒缺乏复制校正机制，变异快，疫苗开发难度大。用于开发RNA复制子疫苗的RNA病毒包括：甲病毒、黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒和杯状病毒等。大量双链RNA可诱导被感染细胞凋亡，宿主细胞的凋亡有利于免疫系统识别外源抗原。RNA病毒的基因组结构加以改造，构建成RNA载体，制备成疫苗，可激发比传统DNA疫苗更高效的免疫应答。甲病毒：有包膜的正链单链RNA病毒是一类由吸血昆虫（蚊虫）或节肢动物为传播媒介的病毒但是RNA容易降解、稳定性差，体内转移效率低，限制了RNA疫苗的使用。具有“自我复制”功能的RNA疫苗增强其的免疫效应。Ying等人构建了包含野生型甲病毒SFVRNA复制酶的RNA载体，肌内注射0.1μg即可诱导产生抗原特异性抗体和CD8+T细胞反应。此RNA载体免疫可保护小鼠免受肿瘤攻击，延长荷瘤小鼠的生存期。RNA复制子疫苗利用RNA病毒的能够自主复制的RNA外源抗原基因（代替结构蛋白基因）+非结构蛋白（RNA复制酶）基因。RNA载体在细胞质中高水平复制，实现外源抗原基因的高水平表达，同时诱导细胞免疫和体液免疫应答。不足：体外转录和加帽，操作、保存及运输不方便，成本较高随着病毒cDNA感染性克隆的建立self-replicatingRNAvaccineDNAvaccine“自杀性”DNA疫苗（suicidalDNAvaccine）“自杀性”DNA疫苗在病毒非结构蛋白基因上游插入强启动子元件（如CMV的早期启动子/增强子）直接在体内启动全长基因组的转录，一旦由强启动子驱动的甲病毒非结构蛋白编码的复制酶复合物合成，便可介导细胞浆内重组RNA的大量复制，从而导致外源基因编码的mRNA的高水平表达，激发很强的免疫反应。甲病毒复制子能在短时间内诱导被转染细胞发生凋亡（一般为2~5d），凋亡产生一系列“危险信号”，可使表达抗原更易被树突状细胞摄取激发许多免疫刺激因子（如HSP、IFN和PKR）的产生。外源蛋白的RNA复制子可由三种方式递送(1)体外转录的裸RNA（基于RNA）(2)质粒DNA直接转染细胞，在CMV启动子控制下由细胞RNA聚合酶Ⅱ胞内转录成复制子RNA，再在复制酶控制下复制RNA。外源基因由亚基因组mRNA启动子（26SsubgenomicmRNApromoter）控制转录成mRNA，并高水平表达；(3)由辅助RNA反式提供结构蛋白将复制子RNA包装入病毒复制子颗粒。甲病毒载体疫苗分成三类：复制-包装型载体（复制型载体)：病毒滴度可达108/mL-109/mL。外源基因通常为2kb以下RNA复制子载体（复制缺陷型载体）DNA-RNA载体:病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA树突状细胞疫苗、T细胞疫苗肿瘤疫苗、治疗性疫苗的研究进展树突状细胞（DendriticCells，DC）DC：最先由Steinman在1973年描述，是体内最活跃、功能最强大的专职抗原提呈细胞。DC广泛存在于淋巴组织和非淋巴组织中，在血细胞中占单个核细胞总数的0.5%～1％。在大多数组织中，DC以不成熟形式存在，其MHC、共刺激分子和黏附分子的表达低，不能够有效地捕捉抗原和激活T细胞。而多种细胞因子能够在体外培养中刺激外周血、骨髓和脐血中DC前体，如在GMCSF、IL-4和TNF-a的作用下，产生成熟的树突状细胞。树突状细胞疫苗以适当形式的肿瘤抗原，不论是蛋白质、多肽还是核酸加载的DC疫苗都能够激活杀伤肿瘤细胞的抗原特异性T细胞，并可产生免疫记忆效应。荷载抗原的DC具有疫苗的功能，因此称为树突状细胞疫苗。DC疫苗主要有三大类，即细胞性肿瘤抗原修饰的DC，肿瘤抗原肽修饰的DC和肿瘤抗原基因转染的DC。主要的肿瘤免疫逃逸机制理论依据将机体的DC提取出，经体外各种免疫调节剂的激活，各种形式抗原（肿瘤抗原肽、细胞性抗原、DNA或RNA等)修饰DC肿瘤回输体内，激活更多的T细胞，产生更强大的抗肿瘤免疫反应，可解决因DC功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸。美国：杜克大学前列腺癌病人分泌前列腺特异抗原（prostate-specificantigen，PSA）树突状细胞利用PSA的RNA产生和呈递PSA抗原，它们被注射回病人体内，以激发T细胞攻击肿瘤。国内体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原-卡介苗热休克蛋白70复合物(HTA-HSP70-BCG)诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应总的来说肿瘤抗原肽冲击DC肿瘤细胞性抗原冲击DC肿瘤细胞RNA冲击DC肿瘤细胞与DC相互作用基因修饰DC的免疫治疗抗原肽冲击DC的亚细胞结构瘤苗DC疫苗的佐剂Okada等用C3恶性肉瘤特异性抗原E7冲击C57B116小鼠来源的DC,回输体内可以抵抗同种瘤细胞的攻击,经3周反复注射疫苗后,67%患有大C3肿瘤7d的小鼠达到长期存活大于90d,而对照组则不超过41dZitvogel等用酸洗脱的肿瘤多肽对GM-CSF、rmIL-4活化的骨髓DC进行冲击，5×10个DC数次回输可明显抑制小肿瘤灶的生长速度,甚至有的病灶完全消失由于DC是主要通过胞饮和甘露糖受体介导方式摄取抗原,有研究表明对蛋白抗原的糖基化（甘露糖化）可使其刺激MHC-Ⅱ限制的特异性T细胞效应提高约200-1000倍。优势DC疫苗的使用方法灵活多变无须明确的肿瘤抗，可激发肿瘤特异性CTL活性及产生保护性免疫降低肿瘤发生率或延长存活时间DC疫苗比肽疫苗具有更广阔的前景DC的临床应用近两年DC疫苗已获得美国FDA批准，正式进入临床试验目前国外已用DC瘤苗对黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、妇科肿瘤、内分泌肿瘤及血液肿瘤等进行Ⅰ、Ⅱ期临床试验上海市动物细胞工程技术研究重点实验室和第二军医大学国际合作肿瘤研究所共同研制的DC疫苗已进入三期临床阶段在临床应用上的问题:①由于严格的MHC限制性，必须从患者外周血中分离、扩增制备大量的DC后再回输入，此技术难度较高②体外扩增后DC的性质、抗原提呈能力是否发生变化有待进一步验证③针对不同的肿瘤治疗方案，需要确定致敏DC所需的抗原/RNA剂量、DC的免疫途径、剂量、次数、间隔时间等。T细胞疫苗(Tcellvaccination,TCV)一将引起自身免疫性疾病的自身反应性T细胞或导致同种移植排斥反应的同种反应性T细胞活化并灭活后作为疫苗，可诱导机体产生针对致病性T细胞或同种反应性T细胞的免疫应答，从而消除或减轻这些细胞的致病作用.称为T细胞疫苗(Tcellvaccination,TCV)MHCⅠ类分子特异的多肽结合基序(MHCbindingmotif)合成的多肽，在体外诱导产