高效液相色谱分析技术—方法开发(陈桂良)

高效液相色谱分析技术—方法开发上海市食品药品检验所陈桂良方法开发方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。建立高效液相色谱分析方法的一般步骤•通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：•①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。•②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。•③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。•④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。分析物•理化性质•混合分析物的主要差异•分子结构和特性●方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质----决定前处理方法溶解性----决定正、反相方法酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成pKa----确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、Etc.●方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱极性差异----用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异----用芳香选择性色谱柱混合差异----用多种选择型色谱柱分子量差异----GPC、GFC●方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.如何得到最理想的分析结果流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件:流动相固定相pH温度如何选择适当的色谱柱理想的柱子•可以适用于分析所有的化合物•永远不会坏•理想分离度决定峰分离度的三个要素•峰保留时间•选择性(出峰的顺序)•柱效固定相的选择•疏水性的选择•极性的选择•苯基的选择固定相疏水性考虑的要素•键合相的种类(C18,C8,Phenyl,etc)•表面积•键合相的键合率色谱柱选择表•颗粒直径及形状(球型及不规则型)•柱长及柱内径•表面积及孔径•碳负荷及键合类型Luna™C18(2)GinsengRootColumn:Luna5µmC18/ODS(2)Dimensions:150x4.6mmIDElutionType:GradientEluentA:Acetonitrile/water(15:85)EluentB:Acetonitrile/water(80:20)FlowRate:1.5mL/minTemperature:25°CDetection:UV-VisAbs.–VariableWave.@205nmAppID1125Luna™C8(2)&C5•减少疏水性化合物的保留时间•减少分析的时间Synergi™Max-RP•疏水性和C18柱类似–为一支C12柱•提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物Synergi™Max-RPBasicDrugsatNeutralpH疏水性的比较0.0002.0004.0006.0008.00010.000kbutylbenzeneSynergiHydro-RPLunaC18(2)SynergiMax-RPLunaC8(2)LunaC5LunaPhe-HexJupiterC18SynergiPolar-RPProdigyPhenylJupiterC4LunaCyanoLunaAminoC18phasesC8phase300ÅC18phase极性选择性的考虑首先考虑•固定相的极性封尾,封端基团•分析物的极性官能基之间的作用极性选择性如何增加极性的选择性•极性基团封端•极性基团镶嵌•苯基极性选择性Columns:Luna™5mC18(2)YMC-Pack™5mProC18Synergi™4mPolar-RP®(Ether-linkedPhenyl)150x4.6mmMobilephase:75:25Methanol:waterFlowrate:1mL/minComponents:1.Estrone2.EstradiolOHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstrone极性选择性min12345mAU0255075100125150175min12345mAU0255075100125150175200min12345mAU020406080100Luna™C18(2)Synergi™Polar-RP®YMC-Pack™ProC181+21+212OHHHOHCH3HEstradiolOHHHOCH3HEstroneSynergiMax-RP-C12SynergiHydro-RP-C18SynergiFusion-RP–C18SynergiPolar-RP–PhenylSynergi™SilicaAdvantageBalancingEfficiency&BackpressureLinearVelocity(mm/sec)PlateHeight(H)5µ4µ3µFlowRate(mL/min)PressureDrop(Bar)higherefficiencieslowerbackpressuresSynergi™Synergi™Max-RP与C18柱性能类似的C12柱Synergi™Polar-RP®•保留极性和苯基化合物•100%水溶液稳定•增加极性的选择性Synergi™Hydro-RP•疏水性非常强•极性封端100%水溶性稳定•增进极性的选择性SynergiHydro-RPVS.Luna®C18(2)Synergi™Hydro-RPSynergiHydro-RPSynergiMax-RPMobilePhase:A:20mMKH2PO4,pH4.6B:AcetonitrileGradient:A/B(95:5)toA/B(65:35)in15minFlowrate:1.5mL/minSample:1.Morphine2.Hydromorphone3.Codeine4.Nalorphine5.OxycodoneSynergi™Hydro-RPSynergi™Fusion-RP•增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间•在水溶液中100%稳定min02468101214mAU0100200300400500VWD1A,Wavelength=210nm(S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\TEST0034.D)min02468101214mAU050100150200250300350VWD1A,Wavelength=210nm(S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\FUSI0046.D)RunningConditionsMobilephase:75:2520mMPotassiumphosphatepH2.5:AcetonitrileFlowrate:1.5ml/minTemperature:AmbientDetection:210nmInjection:1.Maleicacid2.Chlorpheniramine3.Triprolidine4.DiphenhydramineSynergiFusion-RP480Å一般的C18柱极性增大疏水性减少min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO071.D)min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO087.D)min02468101214mAU020406080VWD1A,Wavelength=230nm(F:\PHEN1575\HPCHEM\2\DATA\SW0503\CARLO088.D)SynergiFusion-RPAvgsymm:0.91SynergiMax-RPAvgsymm:0.77LunaC18(2)Avgsymm:0.82RunningConditionsMobilephase:A:25mMTrispH9B:ACNGradient:40%-70%Bin15minutesFlowrate:1.0ml/minDetection:230nmComponents:1.Scopolamine,LogP=2.Lidocaine,LogP=2.443.Noscapine,LogP=1.97NOCH3OOOHOONOOHHOOO苯基的选择性影响•被分析物和固定相之间产生的作用SiCH3CH3OSiOSiOOSiOOHOHLuna™Phenyl-Hexyl•使用甲醇可以增加作用效果Luna™Phenyl-Hexyl•具有疏水性和苯基双重的选择性•重复性高和稳定的苯基固定相Luna™Phenyl-HexylGreenTea(绿茶)Column:Luna™5uPhenyl-HexylDimensions:250x4.6mmMobilePhaseA:0.2%AceticacidinWater/Acetonitrile(91:9)B:Water/Acetonitrile(20:80)Gradient:100%Atot=25min,(68:32)t=25mintot=35min,hold100%Bfor10min.FlowRate:1ml/minTemperature:350CAppID14436苯基的影响Columns:Luna™5mC18(2)150x4.6mmLuna™5mPhenyl-Hexyl150x4.6mmSynergi™4mPolar-RP150x4.6mmMobilephase:50:50Acetonitrile:20mMPotassiumphosphatepH2.5Flowrate:1.0mL/minComponents:Acidic,aromaticcompounds1.Indoprofen2.Ethylparaben3.Naproxen4.Diflunisal5.Indomethacin6.Ibuprofenmin1234567mAU050100150200250min1234567mAU020406080100120140min1234567mAU020406080100120140•C18(2)•Phenyl-Hexyl•Polar-RP苯基的影响pH的影响当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和柱子两者的影响pH对柱子的影响即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在Si-O-H的微酸游离基pKa~3.5如果流动相的pH是4以上,此Si-O-H的游离基会脱氢,成为带负电的Si-O-(这会造成和分析物之间的极性反应,而造成峰拖尾)如果流动相的pH是8(或10)以上,硅胶会被破坏,造成柱子损害pH对分析物的影响基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于疏水性的非极性反应.所以要增长峰保留时间,必需选择流动相的pH能够让分析物保持中性对酸性分析物(pKa~3-6),基本选择pH在pKa以下对碱性分析物(pKa~9-11),基本选择pH在pKa以上对碱性分析物的分析建议多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以一般分析碱性化合物时,会选择于pH~1.5-3下进行分析.在此pH条件下,硅胶表面的游离Si-O-H会保持中性,减少离子间的二极反应,因而减少峰拖尾,峰型较好但是在低pH条件下,碱性化合物的极性增加,疏水性减少,如果要增加峰保