蛋白质分子的结构解析

蛋白质分子的结构解析一、X射线衍射技术§8蛋白质分子的空间结构解析•X射线的发现是起源于对阴极射线的研究。•伦琴也对阴极射线感兴趣，一个偶然事件吸引了他的注意•发现了一种穿透能力很强的射线——X射线（伦琴射线）•W.K.Rontgen(1845-1923)德国维尔茨堡大学校长，是一个治学严谨，造诣很深的实验物理学家，由于发现X射线，第一个获诺贝尔物理学奖(1901年)X射线发现X射线性质•是一种穿透能力很强的射线•1912年劳厄等人（晶体衍射）确定是电磁波•波长范围0.001---50nm•量子理论----由光子组成的粒子流E=hv=hc/λX射线技术经百年的发展，不仅对其本质和性质有了深入的了解，而且在科研，生产方面有着广泛的应用。例如：在物理、化学、地质、生物、医学、天文、材料、工程等。X射线源X射线管同步辐射电子同步加速器产生的，高速电子在电磁场中运动发出的电磁辐射特点：1、方向性强2、广阔平滑连续谱3、高强度高亮度4、偏振5、高稳定6、脉冲宽度小高速电子打在靶上，产生X射线和热量X射线谱标识光谱连续光谱来源于电子轰击阳极时的轫致辐射，X射线管的管压低时发出连续光谱原子内层次电子跃迁发出的辐射，与靶材有关，X射线管的管压超过靶的某一激发电位时才有标识光谱与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单年份学科得奖者内容1901物理伦琴WilhelmConralRontgenX射线的发现1914物理劳埃MaxvonLaue晶体的X射线衍射亨利.布拉格HenryBragg劳伦斯.布拉格LawrenceBragg.1917物理巴克拉CharlesGloverBarkla元素的特征X射线1924物理卡尔.西格班KarlManneGeorgSiegbahnX射线光谱学戴维森ClintonJosephDavisson汤姆孙GeorgePagetThomson1954化学鲍林LinusCarlPanling化学键的本质肯德鲁JohnCharlesKendrew帕鲁兹MaxFerdinandPerutz1962生理医学FrancisH.C.Crick、JAMESd.Watson、Mauriceh.f.Wilkins脱氧核糖核酸DNA测定1964化学DorothyCrowfootHodgkin青霉素、B12生物晶体测定霍普特曼HerbertHauptman卡尔JeromeKarle鲁斯卡E.Ruska电子显微镜宾尼希G.Binnig扫描隧道显微镜罗雷尔H.Rohrer布罗克豪斯B.N.Brockhouse中子谱学沙尔C.G.Shull中子衍射直接法解析结构1915物理晶体结构的X射线分析1937物理电子衍射1986物理1994物理1962化学蛋白质的结构测定1985化学X射线衍射原理x-ray的衍射实验现象•x-ray射入样品，其背后放置照相底片。•非晶体：沿x-ray传播方向形成一个斑点。晶体：除透射束形成的中心斑点外，周围还有有规律分布的其它斑点。•说明有偏离原入射方向的x-ray存在。x射线的衍射•x-ray遇到晶体后所产生的上述现象称为x-ray的衍射，偏离原入射方向的射线称衍射线，底片上出现的图形称衍射图，图上的斑点称衍射斑点。•利用x-ray研究晶体结构中各类问题，主要是通过x-ray在晶体中产生的衍射现象进行的。劳厄斑点产生原因•x-ray的衍射现象是x-ray散射的一种特殊表现。•晶体由有序排列的质点组成，当x-ray与质点相遇时，首先被晶体各个原子中的电子散射，每个电子都是一个新的辐射波源，其波长与原射线相同。x射线的衍射•原子在晶体中是周期排列，散射波之间存在着固定的位相关系，它们之间会在空间产生干涉。•衍射：原子在晶体中的周期性排列使得x-ray散射在一些特定的方向加强，而在其它方向减弱的现象。•x-ray衍射实质：大量原子散射波互相干涉结果•相干散射是衍射的基础，而衍射则是晶体对x-ray散射的一种特殊表现形式，并非x-ray与物质相互作用的新现象。布拉格定律布拉格方程的导出•布拉格定律是衍射几何规律的表达式。•假设：①晶体是理想的简单点阵。②原子是几何点，电子集中在点上散射。③入射的x-ray严格平行。④原子不做热振动。布拉格方程•晶体是由（hkl）晶面堆垛而成的，即一系列平行等距原子面层层叠合而成。•干涉加强的条件是：晶体中任意两相邻原子面上的原子散射波在原子面反射方向的光程差为波长的整数倍。即：△=nλn=1，2，3，…晶体的三维光栅Three-dimensional“diffractiongrating”dx-ray作用于单原子面上•任意两相邻原子的散射波在原子面反射方向上的光程差为：R=0•一个原子面对x-ray的衍射可以在形式上看成原子面对入射线的“反射”。x-ray作用于多原子面上•经两相邻原子面反射的反射波光程差：R=2dsinθ布拉格方程•干涉加强条件（布拉格方程）为：式中：n—整数，“反射”级数（衍射级数）一组（hkl）随n值的不同，可产生n个不同方向的反射线。θ—布拉格角（入射线与晶面）半衍射角ndsin2布拉格方程的讨论1•反映了衍射方向与晶体结构的关系，说明了衍射所必备的条件。（表达了：反射线空间方位、反射晶面间距、入射线方位、入射波长之间的相互关系）•x-ray在晶体中产生衍射，其θ、d、λ必须满足布拉格方程。•布拉格方程与光学反射定律合在一起称为布拉格定律，或x-ray“反射”定律。布拉格方程的讨论2x-ray在晶面“反射”与可见光镜面反射比较：•相同点：①两角相等②三线共面•不同点：①可见光反射仅限于物体表面；x-ray不仅在表面而且能进入晶体内部。②可见光以任意角度入射都可进行反射；x-ray只有特殊角度才能进行反射，称为x-ray的“选择反射”。布拉格方程的讨论3产生衍射的极限条件：•波长：sinθ=≤1λ≤2d•晶面数：d≥•衍射级数：dn22dn2X射线衍射仪的基本结构x射线衍射图2θOntheinterfaceInthepaste小结•利用x-ray研究晶体结构问题，主要是通过x-ray在晶体中产生的衍射现象。•x-ray在晶体中的衍射，实质是大量原子散射波干涉的结果，每种晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。•x-ray衍射理论要解决的中心问题：在衍射现象和晶体结构之间建立起定性和定量的关系。衍射线在空间的分布晶胞的大小、形状和位向衍射线束的强度原子的种类及在晶胞中的位置•布拉格定律反映前者，衍射强度理论解决后者。晶体结构衍射现象二、X射线衍射技术的在结构生物学中的应用举例1、DNA双螺旋结构的发现DNA晶体X射线衍射花样34埃20埃亮度一致亮度不一小沟大沟JamesWatsonFrancisCrickMauriceWilkinsRosalindFranklin1957年,JohnKendrew——肌红蛋白2、X射线晶体学全解析的第一个蛋白质结构－－肌红蛋白一条多肽链+一个辅基多肽链：由153个氨基酸残基组成分子量：16700肌红蛋白晶体化及衍射实验(NH4)2SO4数日后肌红蛋白缓冲液3M(NH4)2SO4pH7肌红蛋白溶液肌红蛋白晶体肌红蛋白晶体X射线衍射花样肌红蛋白电子密度图(部分)低解析度肌红蛋白模型高解析度下的肌红蛋白模型三、蛋白质分子的晶体培养及解析（三）蛋白质晶体的初步鉴定和挑选1、刮擦法2、脱水法3、染色法4、偏振光法5、密度差法适合X射线衍射的蛋白质晶体大小：0.2～0.5mma.采用石英毛细管安装晶体；b.低温数据收集时的晶体安装蛋白质空间结构解析总结