2-2-蛋白质结构解析

第二章第二节蛋白质结构解析蛋白质的氨基酸序列分析生物质谱X-射线晶体衍射技术核磁共振技术主要内容一、蛋白质和多肽的氨基酸序列分析Synopsis:1.Apracticalapproachtodeterminingaminoacidsequencerequiresamethodtoremoveoneaminoacidatatimefromapolypeptidechain.2.Thisisachievedbytheuseofphenylisothiocyanate（异硫氰酸苯酯）astheN-terminallabelingreagent,theEdmanmethod(亦称PTC法或PTH法).3.Thistechniquecanonlydealwithchainsof20to60aminoacids,andmostproteinsaremuchlarger.4.Tocompletetheprocess,selectivehydrolysisofthepolypeptidechaincutsverylongpolypeptidesintospecificfragmentsofmoremanageablesize.1.N端序列分析Sangerwasthefirstpersontodetermineaproteinsequence,forinsulinin1953.Theproblem:afterlabellingtheN-terminalaminoacid,thepolypeptidechainmustbehydrolysedtoisolateandidentifythelabeledaminoacid.What'sneededisawaytoremovethefirstaminoacidwithouthavingtohydrolyzethewholechain.ThiswassolvedbyPerEdman,inSwedenin1956,byusingthereagentphenylisothiocyanatetolabeltheN-terminalendofthepolypeptidesample.ItworksbycleavingtheN-terminalAAoffandleavingtherestofthepeptideintact.TheEdmanmethodcanberepeatedonthepeptideremainingafterthereaction,sothisisaveryeffectivemethodforobtainingAAsequenceinformation.InfactthewholesequenceofapeptidecontainingmanyAAscanbedeterminedbyEdmanmethod.降解反应分三步1.偶联PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由－氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。2.裂解PTC－蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由－氨基。3.转化ATZ－氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH－氨基酸。4.PTH－氨基酸的鉴定薄层层析，HPLC,GC(气相色谱），质谱分析等。PTH－氨基酸ATZ－氨基酸2.C端序列分析适用1.鉴定重组蛋白是否正确表达2.大规模生产时质量控制3.N端封闭蛋白的分析4.DNA探针的设计原理化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分析。质谱：MassSpectrometry(MS)指带电原子，分子或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。二、生物质谱技术质谱（MS）技术的基本原理样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。软电离技术：离子化过程中不会破坏分子结构电喷雾电离（ESI)基质辅助激光解析电离（MALDI)质谱仪组成：离子源，质量分析器，检测器MALDI–MS电离基本原理：将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。TheMALDIinstrumentisamatrixassistedlaserdesorptionionisation-time-of-flight（TOF)massspectrometer，specificallyforhighthroughputmassmappingofpeptidedigestfragmentsoriginatingfromproteinsexcisedfrom2D-gelsi.e.proteomics.matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry(MALDI-TOFMS)linearmodeandreflectionmodeMALDI离子源电离技术的关键----基质的使用基质的作用：样品离子形成过程中充当质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。常用基质：SA(芥子酸）DHB(龙胆酸）CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸）ESI-MS电离方法：靠强的电场使分子电离。分析物溶液流经一个毛细进样针，针头上加高电压用来产生正离子。高电压导致样品液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气体流作用下，溶剂蒸发，液滴缩小，电荷密度增加，最终液滴爆裂，离子从液相中释放出来进入气相。ESI-MS优势：可与多种分离技术联合使用，如LC-MS,HPLC-MS等。Itisoperatedwithelectrosprayionisationandsamplescanbeintroducedintothemassspectrometerbyanumberofdifferenttechniques.1.分子量测定2.肽谱测定3.多肽和蛋白质序列测定4.巯基和二硫键定位5.蛋白质翻译后修饰6.蛋白质复合体分析7.蛋白质组研究应用三、X射线晶体衍射技术X–raydiffractionmethod使用X射线作为物理工具，间接地研究蛋白质晶体的空间结构。X–raydiffractiontechniquesgiveinformationaboutthestructureofsolids,thatis,thearrangementoftheatomsthatcomposethesolid.X射线晶体衍射的基本原理原理:X射线入射到样品晶体分子上时，分子中的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。分析衍射图形可以得到样品内部的结构信息利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。不足之处蛋白质X射线晶体结构测定的基本过程：1.经基因克隆，表达后生成的蛋白质提纯；2.晶体生长并经冷冻处理；3.重原子衍生物制备；4.衍射数据收集；5.衍射数据分析和改进；6.获得最后的结构模型（包括修正）。1.对原材料的要求应具有高度均一性2.晶体生长的生化，物理条件pH值，离子强度，温度等3.技术和方法分批静置法(batchmethod)悬滴法(hangingdrop)4.蛋白质晶体的鉴定蛋白质结晶和晶体生长Crystallization四、核磁共振波谱技术Nuclearmagneticresonance(NMR)核磁共振是研究处在静磁场中的原子核与电磁波相互作用的学科。NMR技术是目前唯一能够用以测定蛋白质溶液三维结构的方法。NMR测定蛋白质三维结构的基本过程•原理:核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radiofrequency,RF）辐射的物理过程。•近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。应用方面：1.2D和3D－NMR方法已提供相当数量的小蛋白质，寡核苷酸，寡糖的三维结构。2.提供有关局部结构，构象动力学的信息。3.用来表征电荷状态、构象、与配体结合的解离速度、研究蛋白质卷曲与折叠。4.鉴定蛋白质分子中某些原子与配体分子中某些原子的相互接触，研究大分子之间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。第五节溶液中蛋白质分子构象的研究方法一.紫外吸收法二.荧光光谱法三.圆二色性小节质谱分析是蛋白鉴定的有力工具X射线晶体衍射技术是最主要、最准确的蛋白空间结构测定方法。NMR是新发展起来的技术，在蛋白三位空间结构测定、蛋白质反应动力学、蛋白质与配体的作用方面有重要的作用。但是，对于柔性的、结构复杂的、难以结晶的大分子蛋白质无能为力；NMR对质量较大的蛋白质也没有办法。