第一章-细胞培养的设施与基本条件

1.1细胞工程实验室的设置1.2常用仪器与设备1.3实验室的生物安全（自学）第一章细胞培养的设施与基本条件预防培养细胞受到污染是细胞培养成功与否的关键为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能力等方面处于最佳状况。而体外培养的细胞由于失去了对整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质提出了较高的要求。为了最大限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方法等制定了严格的规范要求。细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因子的影响。一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备和储藏区位于此两区之间。动物细胞工程实验室的设置1.1细胞工程实验室的设置有其特殊的设置，如具有光照条件的培养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室等。植物细胞工程实验室的设置基本实验室1.1清洗间根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30~50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材料等。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1~2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。地面应耐湿并排水良好。超声波清洗机电热干燥箱纯水仪洗瓶机主要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。面积60m2左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、器械柜、天平、微波炉、pH计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180~200L为宜，用于储存培养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。天平应有不同感量。1.2制备室pH计天平移液器用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与灭菌。配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。1.3消毒间无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器械等。1.4无菌操作室超净工作台离心机为了控制培养室的温度和光照，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照时间及其强度由日光灯和自动定时开关控制。培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。1.5培养室2、辅助实验室2.1鉴定室细胞学鉴定室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等生化分析室在以培养细胞产物为主要目的实验室中，应建立相应的生化分析实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等PCR酶标仪显微镜为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2温室1.2常用仪器与设备基本设备：水纯化装置、冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分装器、搅拌器、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备：超净工作台光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备：光学显微镜、实体显微镜、倒置显微镜等。除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。培养器皿及实验用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用具超净工作台基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高洁净度工作环境。侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或右侧）通过工作台面流向对侧，也有从上向下（或从下向上）流向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有发生污染的可能性外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后的空气面向操作者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；因多为开放式，没有防护挡板，操作和拿取物品方便，但可能受外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。用于细胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒温度范围：50~300℃实验室常用：鼓风式电热干燥箱优点：温度均匀、效果较好；缺点：升温过程较慢注意事项：1、升温时不能先升温后鼓风，应鼓风与升温同时开始，至100℃时停止鼓风2、消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而致玻璃器皿损坏，应等温度自然下降至100℃以下时方可开门3、温度过高可致包裹玻璃器皿的纸或棉花烧焦，烧焦碎屑影响细胞的生长电热干燥箱水纯化装置所有与培养细胞接触的液体均需用纯水配制；三次蒸馏水冰箱储存各种溶液和短期保存组织标本等；-20℃储存需冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，酶、血清、抗生素、谷氨酰胺等专属专用，不存放挥发、易燃等对细胞有害的物质保持清洁压力蒸汽消毒器直接或间接与细胞接触的物品均须消毒灭菌处理内热源侵入式电加热压力蒸汽消毒器注意事项：严格按照操作说明执行细胞计数板也称血细胞计数板，进行培养细胞计数和活性细胞的观察电子细胞计数仪自动计数细胞悬液中的细胞数，尤其适用于进行细胞生长曲线实验过滤除菌装置适用对象：含维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质的人工合成培养液、血清、胰蛋白酶等，高温或射线照射下易发生变性或失活Zeiss滤器•金属，直径142mm和293mm•抽滤式（负压）：进液口与一盛液瓶相连，缓慢使气体回流，在抽滤瓶与真空抽气泵之间连一个负压瓶•加压式（正压）：连一正压泵或蠕动泵的密闭滤器，通N2气体以造成容器内压力，使滤液滤过，调整N2压力不超过19.6kPa；压力比较恒定，滤过效果好，蛋白质不易变性玻璃漏斗式滤器•滤板与玻璃漏斗为一体，根据滤板的孔径可分为G1~G6几种规格，仅G5和G6能达到滤过除菌的要求•适用于各种培养液的过滤除菌，不宜过滤血清等粘稠液体；仅抽滤式，用后清洗麻烦微孔滤膜滤器•换膜式滤器和一次性滤器•微孔滤膜，孔径0.1μm（可去除支原体）、0.22μm（除菌效果较保险）、0.45μm和0.8μm离心机分离细胞、调整细胞浓度、洗涤、收集细胞等低速；高速（DNA、RNA提取）、大容量、控温离心机（神经细胞）移液管：玻璃、塑料材质；1、2、5、10、20ml吸管移液器：微量移液器、多通道可调式微量移液器、电动移液器离心管：塑料和玻璃材质天平动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：培养箱：恒温培养箱、CO2培养箱（适合开放式或半开放式细胞培养，恒定提供定量CO2，通常使用条件为37℃、5%CO2）显微操作仪：细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等细胞融合仪：细胞融合细胞冷冻储存器：程序化冷冻仪、液氮容器（液氮温度低达-196℃，防止冻伤；液氮挥发，定期观察，补充）培养用器皿手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件培养用器皿•透明度好、无毒的中性硬质玻璃：多数细胞可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，透明便于观察；易碎、清洗时费人力•无毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；费用较高1）培养皿：玻璃或塑料制成，盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验，常用规格3.5cm、6cm、9cm、10cm等2）培养瓶：培养细胞种类要求不同，形态各异；细胞传代：瓶壁厚薄均匀，瓶口大小一致，口径一般不小于1cm；规格有10ml、25ml、50ml、100ml、200ml等；外周血培养常用10ml普通原瓶3）培养板：细胞培养、细胞克隆及各种检测；常用规格有4孔、6孔、12孔、24孔、96孔等4）旋转培养器：用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件；手术刀柄、手术剪、镊子、止血钳、持针器；各种器械至少配备两套，使用后及时清洗，做防锈处理；高压蒸汽消毒或75%酒精浸泡消毒植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：光照培养箱：植物材料少量培养；光照、暗箱；调湿与不可调湿；人工气候箱（全自动调温、调湿、控光）人工气候室：模拟自然界的各种气象条件，精确控制室内的温度、光照、湿度、CO2等，在种子发芽、植物培养、组培、植保等领域应用广泛摇床：细胞悬浮培养，常用振荡速度100r/min培养瓶：玻璃三角瓶、试管、光口玻璃瓶；硼硅酸盐玻璃器皿2.1动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：培养箱（恒温培养箱和CO2培养箱）、显微操作仪、细胞融合仪、细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮容器）、培养用器皿、手术器械2.2植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：光照培养箱、人工气候箱、摇床和培养瓶第2章清洗与消毒离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，微生物、细胞碎片以及非营养性化学成分都可能影响细胞的生长，对培养器皿清洗与消毒的要求极为苛刻。因此，清洗和消毒是否彻底直接关系到细胞培养的成败。掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是细胞培养工作的基本功。洗涤液的配制一、清洗玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于4h），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。使用过玻璃器皿：先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。胶塞清洗新购置的瓶塞带有滑石粉及杂质。方法：先用自来水冲洗；每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH（洗衣粉）煮沸10~20min；自来水冲洗后，1%稀盐酸浸泡30min，或蒸馏水冲洗后再煮沸10~20min，晾干备用。聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，无毒、特殊包装优点在生物学实验中应用越来越广泛。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH=1）清洗，接着依次用无离子水、1mol/LKOH和无离子水清洗，然后用10-3mol/LEDTA除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5％的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。使用过程中，注意：防止划痕