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第一单元生物技术与生物工程第一章基因工程和蛋白质工程第一节基因工程的原理1．简述基因工程的诞生。2．简述基因工程的原理及技术。(重点)3．尝试DNA的提取与鉴定。(难点)知识点一|基因工程的诞生与操作工具1．诞生历程时间科学家事件1967年发现了史密斯等首次提取出1970年提取了1972年伯格等构建了世界首例1973年科恩等成功培育出DNA连接酶核酸限制性内切酶T4DNA连接酶体外重组的杂合DNA分子双重抗性大肠杆菌2.操作工具(1)核酸限制性内切酶——“基因手术刀”脱氧核苷酸序列(2)DNA连接酶——“基因缝纫针”①作用：将两个DNA片段连接起来，修复被限制性内切酶切开的切口，拼接成新的DNA分子。②种类：T4DNA连接酶(把限制性内切酶切开的的缝隙“缝合”起来)。黏性末端(3)载体——“分子运输车”①载体的特点ⅰ.外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的。ⅱ.有适宜的酶切位点，最好是对多种限制性内切酶有。ⅲ.具有某些。ⅳ.载体应对无害。自我复制限制性内切酶单一切点标记基因受体细胞②载体的种类ⅰ.质粒：它是细菌中独立于之外的小型环状DNA分子。ⅱ.或其他一些病毒。细菌DNA噬菌体[合作探讨]探讨1：下图表示限制性内切酶切割某DNA分子的过程，从下图中可知，该限制性内切酶能识别的碱基序列及其切割位点是什么？提示：GAATTC，切点在G和A之间。探讨2：结合DNA复制的过程分析，限制性内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？提示：限制性内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。探讨3：如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生了下述变化，则X酶是什么？提示：DNA连接酶。[思维升华]1．核酸限制性内切酶(1)来源和种类切割DNA的工具是核酸限制性内切酶，又叫限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已分离出的约有4000种。(2)作用限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)识别序列的组成一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成。(4)作用结果当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。【特别提示】①限制酶作用的结果通常有两种形式——黏性末端或平末端；②限制酶的作用特点体现了酶的专一性。2．DNA连接酶(1)分类根据DNA连接酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：①从大肠杆菌中分离得到的DNA连接酶，称为E·coliDNA连接酶；②从T4噬菌体中分离出来的DNA连接酶，称为T4DNA连接酶。(2)作用这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。【特别提示】E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。3．载体(1)常用载体——质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。(2)载体的条件①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；②具有多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；③具有标记基因，便于进行检测和筛选。(3)其他载体在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。1．下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是()A．其化学本质都是蛋白质B．DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键C．在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶D．它们不能被反复使用【解析】限制酶和DNA连接酶的化学本质均为蛋白质，DNA连接酶的作用是将两个DNA片段连接起来，DNA聚合酶的作用是把单个脱氧核苷酸连成脱氧核苷酸链。【答案】A2．核酸限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，核酸限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。(1)请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。(2)请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接？为什么？【解析】本题考查核酸限制性内切酶切割DNA的方式，将限制酶能识别的序列写出，再将限制酶切点处标出，可用虚线画出，然后可沿着虚线将片段一分为二，这样便能正确画出核酸限制性内切酶将DNA切出的黏性末端了。若限制酶切割后产生的黏性末端能互补配对，形成的黏性末端便能连接，否则不能。【答案】(1)—G↓GATCC——CCTAG↑G—―――――→用酶Ⅰ切割—GGATCC——CCTAGG—目的基因(2)—↓GATC—……—↓GATC——CTAG↑—……—CTAG↑—―――――→用酶Ⅱ切割目的基因—GATC—……—GATC——CTAG—……—CTAG—(3)可以连接；因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互补的)。知识点二|基因工程的概念与一般程序1．概念基因工程是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在剪切，并与特殊的进行重新组合，然后转入另一种生物的体内，并使之表达产生所需的技术。它可以在分子水平上改造生物的遗传性状。体外运载工具进行扩增蛋白质定向2．一般程序(1)目的基因的获得①目的基因：在基因操作中使用的。②获取方法ⅰ.直接分离法：直接从中获取目的基因，最常用的方法是“”，又称“霰弹法”。ⅱ.人工合成法：主要包括和两种。外源基因基因组鸟枪法反转录法化学合成法(2)重组载体的构建①方法：用分别切割质粒和目的基因，再用将它们连接起来。②重组载体的作用：携带进入受体细胞。(3)重组载体的导入和筛选①转化：将带有的重组载体与相应的放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，使之进入受体细胞的过程。同一种限制性内切酶DNA连接酶外源DNA分子片段目的基因受体细胞②转化方法ⅰ.运用进行转化。ⅱ.法。ⅲ.显微注射法。ⅳ.法。③筛选方法：利用培养转化后的受体细胞。(4)目的基因的表达和鉴定通过检测转化的生物有没有显示出来进行鉴定。载体基因枪花粉管通道选择培养基目的基因控制的性状[合作探讨]探讨1：依据某一蛋白质的氨基酸序列合成的目的基因，其脱氧核苷酸序列是否是唯一的？提示：不是。因为一种氨基酸可能由多种密码子来决定。探讨2：采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的有哪些？①将毒蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③将编码毒蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵提示：③④。探讨3：如何检测抗虫棉中的毒蛋白基因是否表达？提示：让棉铃虫取食抗虫棉，若棉铃虫食后死亡，说明毒蛋白基因表达。[思维升华]1．目的基因的获取(1)从基因文库中获取目的基因①基因组文库：如果一个基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库就叫做基因组文库。②部分基因文库：如果一个基因文库中只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库就叫做部分基因文库，如cDNA文库。(2)人工合成目的基因有两个途径：①反转录法：就是以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成单链DNA，再合成双链DNA。②直接合成法：就是以已知蛋白质的氨基酸序列为基础，推出mRNA的核苷酸序列，再推出目的基因序列，然后进行人工合成。(3)利用PCR技术扩增目的基因PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较PCR技术DNA复制原理碱基互补配对原料四种脱氧核苷酸相同点条件模板、ATP、酶解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶不同点结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子【特别提示】从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因时，目的基因已存在。人工合成目的基因时，目的基因从无到有。2．重组载体的构建(1)构建目的其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建零件及其作用①目的基因②启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。③终止子：相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。④标记基因：其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。【特别提示】由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。3．重组载体的导入与筛选(1)转化：将带有目的基因的重组载体导入受体细胞的过程。①过程图解【特别提示】上图中b与a相比，b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是：在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性；而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因，其优越性在于能有效预防基因污染。②不同细胞转化的比较生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程a.用目的基因转化花粉→受精→获得转化植株b.将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿花粉管进入胚囊，完成转化将重组DNA分子提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子(2)筛选含有目的基因的受体细胞①原理：质粒上有抗生素的抗性基因。②方法：利用选择培养基筛选。4．目的基因的表达和鉴定目的基因导入受体细胞是否能够表达要通过检测来确认，检测的方法有：(1)分子水平检测：①导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。②表达检测转录检测：分子杂交技术，即以标记的目的基因作为探针与mRNA杂交翻译检测：抗原—抗体杂交法(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。1．下列不属于获取目的基因方法的是()A．从基因文库中获取目的基因B．转录法C．反转录法D．根据已知氨基酸序列合成法【解析】解答此题从如下两个方面入手分析：①获取目的基因的途径有两条：一条是直接分离基因，另一条是人工合成基因。直接分离基因也就是“鸟枪法”，人工合成基因又有两条途径，一条是“逆转录法”，另一条是根据已知氨基酸序列合成基因。②所谓转录是指以DNA的一条链为模板，遵循碱基互补配对原则，合成mRNA的过程。此过程不能获得DNA(基因)。【答案】B2．下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题。(1)如何将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒(重组DNA分子)?__________________________________________________________________________________________________________________(2)目前把重组质粒导入细菌细胞时效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。可以通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就说明导入了质粒A或重组质粒，反之则没有。使用这种方法鉴别的原因是_