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报告人：冯姣PCR技术简介PCR技术在食品微生物检测中的应用PCR技术在食品微生物检测中的优势PCR技术在食品微生物检测中的存在问题目录Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术的创建史PCR技术的原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。PCR技术分类荧光定量PCR常规检测多重PCR检测荧光定量PCR检测IMS-PCR检测PCR-DGGE在热稳定DNA聚合酶的催化下，常规PCR检测原理是在存在DNA模板、dNTP、引物、适当缓冲液与MgCl溶溶液的反应混合物中，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。多重PCR(multiplexPCR)的检测原理与传统PCR相同，如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出1条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。与常规的PCR相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测.实时荧光定量是将荧光能量传递技术应用于传统多聚酶链式反应仪中，通过受体发色团之间偶极–偶极相互作用。检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，从而达到定量目的。该技术实现了ＰＣＲ从定性到定量的飞跃，除了具有常规ＰＣＲ的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等ＰＣＲ后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观免疫磁珠技术（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）其原理是磁珠经过一定的处理后，可结合某种微生物特异性抗体，形成免疫磁珠。将这种带有特异性抗体的免疫磁珠加到待测样品中，相应的抗原物质就会和免疫磁珠上的抗体发生特异性结合，形成抗原－抗体－磁珠免疫复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，使复合物与其他物质分离，从而达到快速分离抗原物质的目的。该技术不仅具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度特异性，还具有高效、快速、可重复性好、操作简单和不需昂贵的仪器设备等优点。PCR-DGGE的技术是将PCR和变性梯度凝胶电泳的(DGGE)分析技术结合起来是一种可将长度相同而序列不同的DNA片段混合物分离开的一项技术。DGGE的基本原理是：由于DNA分子中4种碱基的组成和排列存在差异，造成不同序列的DNA分子的解链温度不同，解链时所需的变性剂的浓度也不同。当双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，会致使序列不同的DNA片段会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而使DNA分子的迁移速度不断下降，当产生的迁移阻力与电场力相对平衡时，不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，形成相互分开的带谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，有一个碱基差异的DNA长段都可以被分开。PCR-DGGE技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。①检测样品经预处理后获得DNA模板；②DNA模板的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离后成为单链，以便它与引物结合，为其后阶段反应做准备；③模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，这时人工合成的引物与模板DNA单链经互补序列配对结合；④引物的延伸：DNA模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的催化作用下，以4种三磷酸脱氧核苷酸为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA结构组成相同的新链。重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的新链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，一般单一拷贝的基因循环25~30次DNA便可扩增l00万~200万倍。PCR反应产物再通过凝胶电脉和基因测序等DNA分析技术确定扩增DNA序列的具体信息。PCR操作过程PCR技术在食品微生物检测中的应用常规PCR技术的使用刘胜贵等人利用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌，对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测。对不同稀释度的样品进行PCR扩增，当DNA含量只有0.01pg时，还能扩增出条带，说明该方法检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点。巢国祥等人通过PCR法扩增hly基因建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌（LM）的方法。并检测模拟污染生猪肉、水和牛奶，检测限达10cfu/25g（ml）。改进PCR技术的使用多重ＰＣＲ技术荧光定量ＰＣＲ技术Andsoon!IMS-PCR技术PCR-DGGE技术梁会营等根据阪崎肠杆菌外膜蛋白Ａ（ompＡ）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，设计两对特异性引物，并优化了ＰＣＲ的条件，建立了婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。结果表明，该方法具有很高的特异性，混菌检测灵敏度达到103cfu／ml，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。陈伟等对金黄葡萄球菌的nuc基因、单增李斯特菌的hlv基因和蜡样芽孢杆菌的hemolysin基因设计了引物，建立了３种致病菌的多重ＰＣＲ检测体系，结果显示该方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，结果稳定。整个检测过程在16h内完成，检测灵敏度可达ｌcfu／ml。KAWASAKLS等人利用多重PCR方法同时检测肉类中的沙门菌、李斯特菌和大肠杆菌O157:H7，通过UPB增菌培养基增菌后检测敏感性可达到１cfu／25g.李敏等研究表明，将IMS与多重PCR结合，24h内即可检出食品中的单增李斯特菌，最低检测限可达１cfu／25g（ｍＬ）。王晓闻等建立了沙门氏菌的磁捕获－PCR检测方法，实验包括前增菌、免疫磁珠制备分离、DNA提取及PCR扩增，７ｈ即可完成检测过程，且检测灵敏度为９cfu／ml。结果表明该方法操作简便、用时短、检出率高。高虹等建立了奶粉中阪崎肠杆菌ＲＴＱ－ＰＣＲ检测方法。其所建立的方法特异性强，灵敏度高，在2.2-5.4cfu／100ｇ范围内线性关系良好；与ＦＤＡ方法比对实验表明，两种方法的检测结果完全一致。翁文川等人针对单增李斯特氏菌溶血素基因（hlyＡ），设计特异的引物TapMan探针，优化体系，建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的荧光定量ＰＣＲ检测方法，该方法检测低限为１cfu/g，整个流程只需27h。与传统方法进行对比，结果一致。COCOLIN等建立一种直接检测食品中李斯特菌属的分子生物学方法。通过PCR扩增李斯特菌和标准菌株的特异iap基因，扩增产物再用DGGE进行分离，鉴定出五种李斯特菌。李苗云等研究冷却猪肉贮藏过程中的微生物变化，直接提取不同冷藏天数肉样DNA，对细菌16SrDAN的v6-v8区段进行PCR扩增，通过DGGE及序列分析，结果表明，冷却猪肉耗氧贮藏过程中的微生物主要有：热杀索丝菌、莫拉氏菌、气单胞菌、假单胞猪肉菌、葡萄球菌和节杆菌，为快速检测冷却中的微生物污染提供新思路•用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难，那是因为，食品中污染微生物种类相当多，即使是同一种食品中微生物种类也相当多。准确性•一般的腐败菌检测至少需要2～5d，甚至7d以上，由此可见，传统的检测方法最大的缺点就是检测需要时间太长了。检验结果出来时通常产品已经流向市场，对实际生产具有严重的滞后性。而PCR技术检测食品微生物可以在1d之内检测出结果，甚至在几个小时就可以得出检测结果，对食品工业生产具有相当好的指导作用。快捷性1.•食品成分复杂，如果不能有效的排除各因素的干扰，可能会出现假阴性。2.•PCR反应灵敏度高，操作时要求严格，稍不注意有外界DNA介入就会造成假阴性3.•需要建立一套快速有效的提取DNA的方法知识回顾KnowledgeReview