纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]

_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室邮编：201203电邮：[e-mail]电话：[phone]传真：[phone]网址：镍镍离离子子金金属属螯螯合合亲亲和和层层析析介介质质使使用用说说明明书书（（完完全全版版））一、简介金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，既具有特异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀，流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDAAgarose结合作用力要比Ni-NTAAgarose强，在同样条件下Ni-IDAAgarose的载量要比Ni-NTAAgarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTAAgarose更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体应用何种介质视个人习惯以及纯化条件而定。二、性能参数特点特殊NTA、IDA结构设计，蛋白载量大，专一性高，使用寿命长基质6%的交联琼脂糖凝胶配体NTA-Ni2+/IDA-Ni2+配体密度20~40μmol/ml吸附载量≥30mg蛋白(60kda)/ml介质平均粒径100μm最大流速600cm/hpH范围3~10，在位清洗时pH范围可到2~11保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇三、适用范围分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、E.coli表达可溶性his重组蛋白纯化操作说明1.缓冲液配制z缓冲液A（平衡缓冲液）：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。z缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，500mMimidazole（咪唑），用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。z缓冲液C（咪唑浓度稀释液）：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，用高浓度NaOH调节pH值至8.0。注：如使用试剂盒，盒中提供10×缓冲液A、1×缓冲液B和10×缓冲液C的配制干粉。分别在缓冲液A和C的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml，得到缓冲液A和C的10倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进行10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶液。缓冲液B的每包配制干粉可配制1×缓冲液B500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中，最后定容至500ml。每种缓冲液均应在稀释成正常使用浓度以后，再调节pH值。z缓冲液D（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B和缓冲液C按不同比例配制，配制比例如下（100ml总体积）：咪唑浓度缓冲液C(ml)缓冲液B(ml)0mM100010mM98220mM96450mM901060mM8812100mM8020150mM7030200mM6040250mM5050400mM2080各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬-1-_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s，冷却2s，共循环180次破碎菌体；4℃、13000rpm离心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节pH至8.0待上样。3.装柱：z聚苯乙烯层析柱1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。4)在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。z玻璃层析柱1)将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。2)先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。4)在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。4.过柱：1)用5~10倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱；2)上样；3)用5~10倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结合蛋白；4)用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D洗脱；9最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、200、250mM咪唑的缓冲液D分步洗脱，每个梯度2~3倍介质体积洗脱；9最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。5.介质清洗与再生：如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗或再生。z介质清洗：1)用10倍介质体积0.5MNaOH过柱，适当调整流速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上。2)用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱液。3)用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。z介质再生：1)用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mMNa3PO4，300mMNaCl，100mMEDTA，pH8.0）过柱；2)用5-10倍介质体积0.5MNaOH过柱，适当调整流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上；3)用10倍介质体积去离子水洗柱；4)用3倍介质体积10mMNa3PO4，1MNaCl，pH7.4缓冲液平衡层析柱；5)用3倍介质体积20mMNiCl2或NiSO4(溶于去离子水)过柱；6)用3倍介质体积10mMNa3PO4，1MNaCl，pH7.4缓冲液洗柱；7)用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。6.介质保存4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。7.SDS-PAGE检测：1)不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围邮编：201203电邮：[e-mail]电话：[phone]传真：[phone]网址：地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室邮编：201203电邮：[e-mail]电话：[phone]传真：[phone]网址：；2.上样液；3.纯泰®NTA-流穿液；4.纯泰®NTA-洗脱液；5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液2)SDS-PAGE操作流程A.每个胶孔最适蛋白上样量为5~10μg。B.将含5~10μg蛋白的样品溶液与loadingbuffer混匀，90℃孵育5min，取出后5000rpm离心1min。C.上样，15mA/30mA恒流或80V/120V恒压电泳。五、E.coli表达His重组蛋白包涵体纯化操作说明1.缓冲液配制：z缓冲液E：8MUrea，100mMNaH2PO4，100mMTris·Cl，用高浓度NaOH调节pH至8.0。z缓冲液F：8MUrea，100mMNaH2PO4，100mMTris·Cl，用高浓度HCl调节pH至6.3。z缓冲液G：8MUrea，100mMNaH2PO4，100mMTris·Cl，用高浓度HCl调节pH至4.5。各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用。注：也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式进行，只需在缓冲液中加入8M脲或6M盐酸胍。2.样品处理：1)冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿重菌体/5ml缓冲液E的比例充分悬浮菌体。2)室温条件下振摇菌体15～60min，通过温和涡旋振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。溶液变得透明表明裂解完全。3)4℃、13000rpm离心15min，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节pH至8.0待上样。3.操作步骤：1)用10倍介质体积缓冲液E平衡亲和柱；2)上样；3)用10倍介质体积缓冲液E过柱，重新平衡介质；4)用10倍柱体积缓冲液F过柱，洗去未结合的杂蛋白；5)用5~10倍柱体积缓冲液G洗脱，收集洗脱液。6)用10倍柱体积缓冲液A重新平衡介质。注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。六、实验实例1.Ni-NTAAgarose纯化His-tag蛋白z层析介质：纯泰®NTA1ml；对照介质（国际领先品牌）1mlz样品：表达可溶性His-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液z结合缓冲液：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，pH8.0z洗脱缓冲液：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mMimidazole，pH8.0z流速：纯泰®NTA1ml，0.5ml/min；对照介质1ml，0.5ml/min2.Ni-IDAAgarose纯化His-tag蛋白z层析介质：纯泰®IDA1ml；纯泰®NTA1mlz样品：表达His-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液z结合缓冲液：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，pH8.0z洗脱缓冲液：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mMimidazole，pH8.0z流速：纯泰®IDA1ml，0.4ml/min；纯泰®NTA分离胶浓度分离范围6%50～150kD8%30～90kD10%20～80kD12%12～60kD15%10～40kD1234561ml，0.5ml/min1.低分子量Marker；2.上样液；3.纯泰®IDA-流穿液；4.纯泰®IDA-洗脱液；5.纯泰®NTA-流穿液；6.纯泰®NTA-洗脱液234561-3-_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号