链霉素生产的代谢调控

微生物代谢调控的论文链霉素生产的代谢调控摘要：链霉素广泛的应用于临床和农业中，但链霉素的产生菌链霉菌普遍存在遗传不稳定性，大大限制了其功能的发挥，影响了链霉素的产量。本文为提高链霉素产量，从链霉素的生物合成途径、代谢调控机制以及链霉素发酵过程中的优化控制等方面进行了综述。郑忠巧生物工程一班20114129任课教师：杜春梅链霉素生产的代谢调控郑忠巧生物工程一班生命科学学院20114129摘要：链霉素广泛的应用于临床和农业中，但链霉素的产生菌链霉菌普遍存在遗传不稳定性，大大限制了其功能的发挥，影响了链霉素的产量。本文为提高链霉素产量，从链霉素的生物合成途径、代谢调控机制以及链霉素发酵过程中的优化控制等方面进行了综述。关键词：链霉素、发酵、代谢调控、优化控制。链霉素，是一种从灰色链霉菌的培养液中提取的抗菌素，是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。分子量:581.57。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度0.38g/L,pH1.5～3.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效。链霉素为微生物源杀细菌剂，可有效防治植物细菌病害，例如苹果、梨火疫病、烟草野火病、蓝霉病、白菜软腐病、番茄细菌性斑腐病、晚疫病、马铃薯种薯腐烂病、黑胫病、黄瓜角斑病、霜霉病、菜豆霜霉病、细菌性疫病、芹菜细菌性疫病、芝麻细菌性叶斑病。链霉素发酵过程是一个极为复杂的生产过程,尽管国内外工艺技术人员在其上作了大量的工作，但至今为止也不能很好的解释这一生化过程[1]。链霉素还是继青霉素的第二个生产并用于临床的抗生素，它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元，从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。工业上链霉素基本依靠生产经验,使生产中链霉素发酵水平时高时低，经济效益缺少保障，可以利用发酵过程的一些限制因素来促进或控制酶产生的速率，可以控制发酵过程中不同阶段的反应处于平衡状态，同时也可以使微生物对外界环境的变化作出相应的反应,即充分利用代谢调控的手段，可以提高链霉素的量。1链霉素的生产菌种及其生产方法1.1链霉素的产生菌链霉素的生产菌种通常是灰色链霉菌，而链霉菌(Streptomyces)是一种革兰氏阳性丝状放线菌,可产生多种类型的具有重要应用价值的次级代谢产物,链霉素也属于次级代谢产物,而次级代谢产物的产生与细胞复杂的分化密切相[2]。对这些链霉素生物合成中基因表达调控机制的研究,将有利于通过基因工程手段研发链霉素高产菌株和开发新型高效安全的农用和医用链霉素药物。伴随着基因组学和后续蛋白质组学的深入研究,以及相应建立起来的生理模型和数学模型,链霉菌次生代谢和形态分化调控网络的研究也将获得飞跃发展[3]，链霉素的产生量也将得到提高。近些年利用组合生物合成手段,以不同抗生素生物合成相关的调控基因作为研究对象,可以改造细胞内某些代谢途径、控制代谢物质流、提高终产物的产量、甚至产生传统途径中的中间产物[4]，参与次生代谢的这些双因子调控系统,为利用代谢工程的方法对链霉菌进行定向改造积累了丰富的基因资源[5]，从而有利于提高链霉素的产量。1.2链霉素的生产方法链霉素生产过程简单说来是将菌种和原料装人发酵大罐,在恒温条件下,经过200h的发酵后,生产出链霉素[1]，其发酵过程是利用特定的微生物,在一定的条件下使之生长繁殖,并在代谢过程中产生抗生素,然后用适当的化学手段将抗生素从发酵液中提取出来,这是一个典型的分批发酵过程[6]。与一般的发酵过程相比,链霉素的发酵过程具有以下特点：链霉素是次级代谢产物,菌体生产与产物形成不平行；理论产量难以用物料平衡来推算；生产稳定性差。在链霉素发酵的不同阶段,既有菌体自身的生长、繁殖、老化,又有链霉素的合成及水解,存在多种生化过程,其复杂程度远远超过物理、化学过程,而且可能存在的酶反应超过几百个,影响因素繁多,相当一部分的作用仍然不十分清楚。2链霉素的合成途径及其生物调节。2.1链霉素的合成途径由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示[7]。从图1可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个NH3分子、2个CO2分子和1个甲硫氨酸分子。其中，有3个NH3分子是通过转氨基反应分别把氨基供体——谷氨酰氨、丙氨酸和谷氨酸的氨基结合到链霉胍上和L-葡萄糖胺的氨基上，另外4个NH3分子是通过鸟氨酸环供给的，其中2个分子又由氨甲酰磷酸酯，另外2分子由天冬氨酸引入，最后转变为精氨酸的脒基，再转移到链霉胺衍生物上。2个CO2也是通过鸟氨酸循环固定的。在灰色链霉素的发酵过程中，与链霉素同时产生的还有甘露糖链霉素（链霉素B），其化学结构为N-甲基-L-葡萄糖胺的C4与D-甘露糖的C4以α-糖苷键相连接的糖苷，经过甘露糖苷酶作用，可水解为链霉素和甘露糖。2.2链霉素生物合成的调节机制在链霉素生物合成中的调节机制主要有发酵阶段的转变、分解产物的调节以及无机磷的反馈抑制等方面。2.2.1发酵阶段的转变催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时的突然出现是由于新的蛋白质的合成，而不是蛋白质的激活。2.2.2分解代谢产物的调节在发酵过程中，除形成链霉素外，还形成一种支路产物—甘露糖链霉素（mannosidostrpromyclin，又叫链霉素B）。对大多数微生物来说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的20%~25%。直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的α-D-甘露糖苷酶，能迅速把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖，反应如下：链霉素-甘露糖甘露糖苷酶链霉素+甘露糖2.2.3无机磷的反馈抑制正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉素的形成。磷酸盐与链霉素的生物合成过程有密切关系，在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。过量的磷酸盐会产生反馈抑制，阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形成，因而抑制链霉素的合成，因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关系。此外磷酸盐还能调节链霉胍合成的关键酶—脒基转移酶的形成，高浓度磷酸盐严重阻遏该酶的形成[8]。3链霉素生产的代谢调控微生物的代谢调控通常通过以下方式:1.育种，选育基因突变株；2.控制培养条件和发酵工艺，影响其代谢；3.代谢工程又称途径工程，利用基因工程技术改变代谢流，扩展和构建新的代谢途径，通过关键酶连接两个代谢途径形成新的代谢流。经典代谢工程主要过程如下:首先,确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。然后,将编码限速酶的基因通过酶切等手段,制得特定片段,连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达,从而加速限速反应,提高目的产物产率。这样,经典代谢工程通过关键酶的过量表达来解决代谢瓶颈而常被称作推理性代谢工程[9]。3.1菌种的选育链霉素生产菌的育种思路通常从出发菌株的选择、切断之路代谢、解除自身的反馈调节、增加前体物的合成等几方面考虑。3.1.1出发菌株的选择出发菌株多采用灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）、比基尼链霉菌和灰色链霉菌等。灰色链霉菌的孢子梗直而短，不呈螺旋形，孢子数量很多，孢子乃断裂而成，呈椭圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花型或馒头型，直径为3~4mm，基质菌丝透明，在斜面背后产生淡色色素。3.1.2切断支路代谢当初级代谢和次级代谢处于分路途径时，通过选育需要初级代谢产物的营养缺陷菌株可使相应的次级代谢产物增加。据报道，采用诱变的方法获得L-丙氨酸缺陷株，或选育苏氨酸缺陷、芳香族氨基酸缺陷变株，对提高链霉素的产量有一定的作用。3.1.3解除自身的反馈调节（1）选育营养缺陷型的回复突变菌：一个突变株失去某种生化特征，经过2次突变能回复该特征。这是因为当某一结构基因发生突变后，某一酶就因结构改变而失活，而回复突变可以使其活性中心的结构复原，但调节部位的结构并未恢复，结果一方面酶恢复了活性，而另一方面反馈抑制却已解除或不怎么严重。有人通过诱变获得了肌醇缺陷的回复突变株，其链霉素产量提高了5倍。（2）选育高浓度磷酸盐抗性突变株：由于高浓度无机磷对链霉素生物合成有抑制作用，因此选育出耐高浓度磷酸盐的新菌种，也是选育高产单位菌种的一个方向。通过诱变，可以选育出耐高浓度磷酸盐的突变株，它对磷酸盐的敏感性可能降低。从生产控制来看，产生抗生素的无机磷需要量为4.5~11.5mg/100ml比菌体生长所需无机磷的量低得多。因此，发酵培养基中的磷酸盐采用生长的亚适量（suboptimalforgrowth）浓度，使菌体生长受到某些控制，菌体代谢活性转为有利于抗生素生物合成的状态。（3）选育抗链霉素突变株：链霉素本身也可能在链霉素合成中起反馈抑制作用，它能够完全抑制链霉胍激酶。通过在培养基中逐步增加链霉素浓度来培养产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已获得耐高浓度来培养产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已经获得耐高浓度链霉素的菌株，使链霉素的产量得到提高。（4）选育结构类似物抗性突变株：由于某些氨基酸对链霉素生物合成中的某些酶有阻遏作用，因此通过选育某些氨基酸，特别是含硫氨基酸的结构类似物抗性突变株可使链霉素产量提高。据报道，选育乙硫氨酸、蛋氨酸氧肟酸盐、硒代蛋氨酸、1,2,3-三唑、三氟蛋氨酸抗性突变株，均有助于链霉素产量的提高。3.1.4增加前提物合成(1)葡萄糖胺是生物合成链霉素的前体物质。有人采用诱变方法获得了细胞内葡萄糖胺含量提高了3倍的突变株，其链霉素产量比原菌株提高了一倍。(2)精氨酸也是合成链霉素的前体物，增加菌体细胞精氨酸生物合成能力，有利于链霉素产量的提高。(3)脒基转移酶是链霉胍合成的关键酶。有人将脒基转移酶进行了克隆，结果细胞内脒基转移酶的量得以扩增，从而增加了链霉素的前体物链霉胍的积累，造成链霉素产量的提高。3.1.5形态突变株据报道，挑选洁白、丰满，呈梅花型或馒头型菌落常是获得链霉素高产菌的条件。若菌落变成光秃型或半光秃型，气生菌丝减少，颜色改变，孢子数量减少，一般说来，其链霉素的产量也大幅度降低。3.2基因工程育种由于产抗生素的链霉菌遗传结构包括抗生素生物合成、抗生素抗性、氨基酸生物合成、色素生成和发育变化等方面的不稳定，大大制约了链霉菌的工业化生产。许多科研工作者将基因工程技术运用到了链霉菌育种之中，采用各种基因操作技术，使不同化合物、不同来源的基因在同一菌株中重新组合，增加代谢产物的多样性[10]。目前的基因工程技术有以下：（1）利用基因重排技术对出发菌株进行处理可以提高链霉素的产量[11]；（2）通过基因组测序分析，已经发现在链霉菌基因组中大多数情况是生物合成基因以相近的簇形式存在，单拷贝可扩增因子通过速率限制不对称交换以转换成重复结构。组建重组子的可扩增因子和重要基因的拷贝数，也可能提高基因产物的表达量[12]；（3）将生物合成基因与相应的质粒载体重组，导入特定的基因工程菌，由于质粒的高拷贝，诱导表达获得高产量的抗生素；（4）敲除负调控基因，抑制无关代谢活动可增加细胞对目标产物合成在能量和碳源上的供应，从而提高目的抗生素的产量；（5）引入血红蛋白，链霉菌发酵过程中，充足的氧气供给是满足细胞生长代谢的重要因素。改良传统生物反应器及增大通气量的方法均对设备的要求较高，能耗较大。若能在链霉菌中导入血红蛋白基因，表达血红蛋白，就可使该细胞在贫氧状态下也能很好地生长。（6）引入抗性基因和调节基因，链霉素生物合成抗生素的过程中，抗生素耐药性基因往往存在着不同程度的连锁。通过提高链霉菌对某种抗生素的耐药性，增加与目的抗生素生物合成有关的自身抗性基因的拷贝数，也是提高目的抗生素产量的有利途径；（7）利用基因筛选程序，筛选含有特定类型化合物的基因产生菌，进而获得了相应的次生代谢产物[11]；（8）利用基因组重排技术对出发菌株进行处理，基因组重排是以整个基因组为操作对象的一种DNA重排。其本质就是进行多次的原生质体的融合和再生[13]。4.链霉素发酵过程中的控制工业链霉素发酵过程中的变量有发酵时间、pH值、碳源浓度、氮源浓度、粘度、罐温、罐压、空气流量等。