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研究用说明书TaKaRaMiniBESTBacteriaGenomicDNAExtractionKitVer.3.0CodeNo.9763v201308Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存与运输1●实验前的准备1●操作方法2●实验例3●不同起始量菌体提取DNA的线性关系4●注意事项4●不同材料的DNA提取量4●Q&A5●制品说明本试剂盒是专门用于提取各种革兰氏阳性/阴性细菌（Gram-positive/negativeBacteria）基因组DNA的小量纯化试剂盒。试剂盒采用了溶菌酶以及独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA，适用于革兰氏阴性菌及绝大部分革兰氏阳性菌。本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，组织细胞裂解后，提取操作仅需20分钟便可完成。使用本试剂盒可从1.0～5.0E+09（当OD600=1时，认为1ml菌液中含有1.0E+09个细胞）的细菌中纯化得到1~20μg的高纯度基因组DNA，提取得到的基因组DNA可用于PCR反应、Southern杂交以及RAPD、AFLP、RFLP等多种分子生物学实验。●制品内容（50次量）本试剂盒分PartI和PartII两部分■PartI部分（-20℃保存）ProteinaseK(20mg/ml)1mlLysozyme(20mg/ml)*11.25ml×2RNaseA(10mg/ml）500μl*1应尽量避免反复冻融，融化后请于4℃长期保存。■PartII部分（请于室温15~25℃保存）BufferBS28mlBufferGL*112mlBufferGB*112mlBufferWA*128mlBufferWB*224mlElutionBuffer14mlSpinColumns50支Collectiontubes50支*1含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。*2在首次使用前，请添加56ml的100%乙醇，混合均匀。【试剂盒之外所需准备试剂】◆无水乙醇◆灭菌蒸馏水●保存与运输1.本试剂盒分三部分保存，PartI请于-20℃保存，其中Lysozyme（20mg/ml）融化后请于4℃长期保存；PartII于室温下（15-25℃）保存。2.本试剂盒分两部分运输，PartI请于-20℃条件下运输；PartII于室温下（15-25℃）运输。●实验前的准备1.准备37℃（提取Gram-positiveBacteria时需要）、56℃水浴。2.BufferGL若出现沉淀，请于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。3.BufferWB在首次使用前，请添加56ml的100%乙醇，混合均匀。4.洗脱结合于DNA制备膜上的基因组DNA时，将ElutionBuffer或灭菌蒸馏水加热至65℃使用将会提高基因组DNA的洗脱效率。-1-●操作方法操作流程见图1，分为菌体裂解、DNA与膜结合、DNA纯化等步骤，菌体裂解后操作约需20分钟，详细说明如下：◆Gram-negativeBacteria的裂解：①用1.5mlTube收集1.0~5.0E+09的细胞，12,000rpm离心2分钟，弃上清（细胞培养液）。②加入180μl的BufferGL、20μl的ProteinaseK(20mg/ml）和10μl的RNaseA(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10分钟，此时溶液应呈透明、澄清状。③加入200μl的BufferGB和200μl的100%乙醇，充分吸打混匀。◆Gram-positiveBacteria的裂解：①用1.5mlTube收集0.5~2.0E+09的细胞（对于细胞壁结构特殊和生长状态较老的Gram-positiveBacteria，建议起始量不要超过1.0E+09的细胞），12,000rpm离心2分钟，弃上清（细胞培养液）。②加入500μl的BufferBS重悬细胞、加入50μl的Lysozyme(20mg/ml)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60分钟（温育期间可每隔20分钟颠倒混匀一次）。③12,000rpm离心5分钟，弃上清。④加入180μl的BufferGL、20μl的ProteinaseK(20mg/ml）和10μl的RNaseA(10mg/ml），充分吸打混匀，于56℃水浴温育10分钟，此时溶液应呈透明、澄清状（如果此时溶液未透明澄清，可延长裂解时间至30分钟，并每隔5分钟吸打混匀一次）。加入200μl的BufferGB和200μl的100%乙醇，充分混匀。处理好的细胞按如下操作进行：1.将SpinColumn安装在CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。2.将500μl的BufferWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。3.将700μl的BufferWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认BufferWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿SpinColumn管壁四周加入BufferWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。4.重复操作步骤3。5.将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。6.将SpinColumn安置于新的1.5ml离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置5分钟。注）将灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。7.12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。8.基因组DNA定量。提取得到的基因组DNA可通过电泳或测定吸光度定量。-2-处理好的菌体加BufferGL、ProteinaseK和RNaseA56℃温育10min裂解液向裂解液中加200μlBufferGB和200μl的100%乙醇溶液移至SpinColumn中弃滤液BufferWABufferWB弃滤液SpinColumn移至1.5mlTube上加ElutionBuffer基因组DNA溶液清洗SpinColumn图1.操作流程简图处理菌体●实验例1.从Gram-positiveBacteria中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从Gram-positiveBacteria中提取基因组DNA，最终分别从2.0E+09的Bacillussubtilis、Lactobacillusplantarum、Acidiphiliumfacilis、Kocuriakristinae纯化得到了约10μg、6μg、6μg、8μg的高纯度基因组DNA。其电泳结果见图2。M12341%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：Bacillussubtilis基因组DNA2：Lactobacillusplantarum基因组DNA3：Acidiphiliumfacilis基因组DNA4：Kocuriakristinae基因组DNA图2.从Gram-positiveBacteria中提取的基因组DNA2.从Gram-negativeBacteria中提取基因组DNA的实验例使用本试剂盒从Gram-negativeBacteria中提取基因组DNA，最终分别从2.0E+09的Acetobacteraceti、Enterobacteraerogenes、SerratiamarcescensSb、Escherichia.coliJM109纯化得到了约6μg、8μg、8μg、10μg的高纯度基因组DNA。其电泳结果见图3。M12341%Agarose凝胶电泳图M:λ-HindIIIdigest1：Acetobacteraceti基因组DNA2：Enterobacteraerogenes基因组DNA3：SerratiamarcescensSb基因组DNA4：Escherichia.coliJM109基因组DNA图3.从Gram-negativeBacteria中提取的基因组DNA3.从Staphyloccocusaureus中提取的基因组DNA作为模板，扩增3.4kb片段的实验例使用本试剂盒从2.0E+09Staphyloccocusaureus中提取得到约6μg基因组DNA。以此基因组DNA为模板，PCR扩增了R.Sau3AI基因约3.4kb的DNA片段。其电泳结果见图4。M1M21%Agarose凝胶电泳图M：λ-HindIIIdigest1：Staphyloccocusaureus基因组DNA2：PCR扩增3.4kb片段图4.从Staphyloccocusaureus中提取的基因组DNA和PCR扩增结果-3-●不同起始量菌体提取DNA的线性关系使用本试剂盒提取1.0E+09、2.0E+09和5.0E+09Microbacteriumoxydans的基因组DNA，洗脱时使用200μlElutionBuffer洗脱，DNA收量如图5所示。M1231%Agarose凝胶电泳图M:λ-HindIIIdigest1：1.0E+09Microbacteriumoxydans基因组DNA2：2.0E+09Microbacteriumoxydans基因组DNA3：5.0E+09Microbacteriumoxydans基因组DNA图5.不同起始量Microbacteriumoxydans提取的基因组DNA●注意事项1.应尽量使用新鲜的菌体，以确保提取的基因组DNA的收量及完整性。2.部分试剂中含刺激性化合物，操作时请戴上乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤和眼睛等，并应尽量在通风橱中进行操作。若沾染皮肤、眼睛，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。3.基因组DNA需长期保存时，建议用ElutionBuffer溶出。4.菌体起始量不要过多，过夜培养的菌体0.1~1ml集菌即可。●不同材料的DNA提取量（已验证）2.0E+09起始的Gram-positiveBacteria使用本试剂盒所能提取的DNA量如下：-4-材料DNA收量Microbacteriumoxydans6～10μgBacillussubtilis8～10μgKocuriavarians6～10μgStaphylococcusaureus3～8μgEnterococcusdurans.6～10μgPediococcuspentosaceus6～10μgEnterococcusgallinarum5～8μgAnabaenaflos-aquae6～10μgArthrobacterluteus6～12μgNocardia5～8μgBrevibacteriumlinens5～8μgCaryophanonlatumL5～8μgCaseobacterpolymorphus5～8μgStreptomyces5～8μgLactobacillusplantarum5～8μg2.0E+09起始的Gram-negativeBacteria使用本试剂盒所能提取的DNA量如下：材料DNA收量Escherichia.coliJM1096～10μgAcetobacteraceti6～10μgAcinetobactercalcoaceticus10～15μgAcidiphiliumorganovorum13H10～15μgEnterobacteraerogenes6～10μgFlavobacteriumbalustinum10～15μgPlesiomonasshigelloides6～10μgSerratiamarcescensSb8～15μg●Q&AQ1.基因组DNA的收量如何？A1.本试剂盒适合于细菌的基因组DNA提取。基因组DNA的提取量根据细菌不同而各异，一般情况下，从2.0E+09的细