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植物抗病基因的结构特点、抗性表达遗传机理和进化2011201066张志远抗病基因（R）概念从广义上讲植物抗病基因(resistancegene)与防御反应基因(defensegene)都是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。所谓抗病基因所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。抗病基因的抗病机理一、基因对基因假说Flor(1971)根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究提出了基因对基因假说。其基本内容是：病原体与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型，亲和与不亲和病原体分别含毒性基因(VIR)和无毒基因(AVR)，亲和与不亲和寄主分别含感病基因(r)和抗病基因(R)。当携AVR基因的病原体与携R基因的寄主互作时，二者表现不亲和，即寄主表现抗病性；其他3种组合则表现为亲和，即寄主感病。抗病基因的抗病机理二、激发子/受体模型(elicitor-receptormodel)激发子/受体模型是从基因对基因假说发展而来的。该模型认为：病原体的AVR基因直接或间接地编码一种配体(激发子)，它与R基因编码的产物(受体)相互作用，从而触发受侵染部位细胞内的信号传递过程，激活其他防卫基因的表达，产生超敏反应。例如，拟南芥抗病基因Rps2编码的受体蛋白与病原体无毒基因AVRRps2编码的蛋白(激发子)相互识别，产生传递信号，引起活性氧中间体的大量聚集，激活其他防卫基因的表达，导致超敏反应，在病原体侵染部位出现枯死斑点症状，使植物获得抗性。抗病基因的抗病机理三、防卫假说(guardhypothesis)防卫假说认为：在病原体侵染植物并营造适合其生长的有利环境时，病原体把植物体内的一种蛋白——卫兵(guardee)作为靶子并加以改变，这种改变是植物受到病原体侵害的信号。植物抗病基因蛋白(guard)能检测到这种信号——植物卫兵蛋白的改变，其途径可能是通过检测植物卫兵蛋白与病原体毒蛋白形成的复合体。当植物抗病基因蛋白发现其卫兵受到攻击时，抗病性被触发。这个过程可能并不需要抗病基因蛋白和无毒基因蛋白间发生直接的作用。防卫假说中植物抗病基因蛋白不仅能识别无毒基因蛋白，而且能监视被病原体毒性/致病蛋白作为攻击目标的重要植物蛋白/复合体。抗病基因的抗病机理四、信号的产生和传递虽然三个假说的机理不同，但都认为植物的抗病的关键在于植物细胞首先感知胞外信号以及通过膜传入胞内的信号，细胞内信号分子集聚，进一步引起蛋白的磷酸化/去磷酸化反应，信号被传递并且放大，最终增强抗性基因的翻译表达。所以植物抗病，抗病基因发挥着不可替代的作用。抗性基因的结构近年来，由于分子生物学的发展，有很多抗病基因已经被克隆出来，通过序列及氨基酸比对这些抗病基因发现，尽管抗病（R）基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征.根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hml。众多的抗病基因中，有很大一部分的抗病基因都具有核苷酸结合位点（NBS）、富含亮氨酸重复(LRR)和亮氨酸拉链（LZ）基序。先对这几个基序的结构作个介绍。核苷酸结合位点（NBS）NBS存在于真核生物的许多蛋白中,如ATPase、延伸因子(elongationfactors)、异质三聚体、GTP结合蛋白(Gproteins)、R基因编码蛋白等,这些蛋白对于细胞的生长、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防御反应都有关键性的作用。尤其是R基因编码产物中NBS的存在，表明R基因的功能之一是磷酸化，通过磷酸化识别配体，导致一系列抗性反应的发生。NBS主要氨基酸的突变可导致抗性的降低或消失。核苷酸结合位点（NBS）NBS由三个区域组成,第一区域为磷酸结合环(P-loop),又称激酶(kinase)la,作用是结合ATP或GTP的磷酸,第二区域为激酶2,共有特点是4个疏水氨基酸残基后紧跟一个不变的带负电荷的天冬氨酸,但在植物中,这一区域的两边还具有高保守的氨基酸。值得一提的是,含有TIR的R基因产物激酶2最后一个氨基酸残基为天冬氨酸,而其他为色氨酸。第三区域为激酶3a,与DNA的嘌呤或核糖结合有关,通常含有一个精氨酸残基。(a)RPS4和RPS5中NBS结构域的结构,显示保守基序的位置.蛋白质结构是带状图所示:P-loop(蓝色);RNBS-A(绿);kinase-2(品红);RNBS-B(green);RNBS-C(绿);GLPL(黄);RNBS-D(绿);MHDV(橘黄).富含亮氨酸重复(LRR)富含亮氨酸重复(LRR)因亮氨酸在这一结构中呈规律性重复而得名。LRR存在于多种功能不同的蛋白中,与蛋白质之间的相互作用及信号传导有密切关系。在酵母、果蝇、哺乳动物、人体以及植物中均发现含有LRR结构的蛋白存在。如酵母的腺苷酸环化酶、果蝇的Toll蛋白、人血清中的2-糖蛋白、猪的核糖核酸酶抑制蛋白等都含有LRR结构。在植物中,含LRR的蛋白在细胞生长发育、抗病反应过程中起着重要作用,主要有类受体蛋白激酶、R基因编码蛋白和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。R基因编码蛋白所含的LRR结构可大至分为两大类:一类是定位于胞外的LRR,如Cf-2,Cf-4,Cf-5,Cf-9,Xa21;另一类是初步定位于细胞质的LRR,主要见于含有NBS的R基因产物中。除甜菜的Hs1Pro-1的LRR比较接近于胞质LRR外,胞质LRR与胞外LRR在重复数和结构上都有明显的区别。从重复数上看,胞外LRR的重复数一般较高,最高可达38个重复,如Cf-2基因。重复单位一般为24个氨基酸残基,并且绝大多数重复的结构相当完整。而胞内LRR重复数一般仅有14个左右,个别也有21和28的。有趣的是,这些重复数均为7的倍数,重复单位所含的氨基酸残基数虽然也大约为24,但为不完整重复。从结构上看,胞外LRR第14位上的残基为甘氨酸,这是其位于胞外的重要特征,另外第17位上的残基为脯氨酸。富含亮氨酸重复(LRR)从猪核糖核酸酶抑制蛋白晶体立体结构中发现,每个LRR的该部分构成了一个短的β-折叠片,而其下游的氨基酸残基构成了α-螺旋,所有重复的β-折叠片平行于共同的轴心,形成一个非球状的马蹄形结构。在这一结构中,保守的亮氨酸残基形成疏水的核心,而其它非保守的氨基酸残基暴露于马蹄形外周而形成了配体结合表面。R基因LRR的结构与之相似,这使我们在一定程度上能够从分子上解释“基因对基因”的相互作用:即保守的亮氨酸形成疏水的与无毒基因编码蛋白配体结合的结构,而非保守区决定了与配体结合的特异性。富含亮氨酸重复(LRR)根据拟南芥抗病原菌假单胞菌丁香蛋白5（RPS5）中的LRR预测的LRR域结构(a)一个代表性的RPS5LRR域的结构预测。β-折叠形成凹脸的“马蹄形”由箭头所示。保守脂肪残留由蓝色表示。N,氨基末端;C,羧基末端.(b)在12个核心蛋白聚糖中富含亮氨酸重复的比对结果和在RPS5中13重复以及氨基端的9个氨基酸。保守脂肪残留，以蓝色显示。富含亮氨酸重复(LRR)亮氨酸拉链（LZ）LZ存在于一些寡聚蛋白中,许多DNA结合蛋白就含有LZ。LZ中每7个氨基酸残基构成一个重复,第7位置上的残基为(异)亮氨酸。这些(异)亮氨酸在蛋白质二级结构中形成α-螺旋的疏水脊,在疏水交互作用下,两个LZ中的(异)亮氨酸残基形似拉链,将其所在的亚基聚合成多聚体。由于LZ的独特的拉链结构,从而有利于蛋白质的二聚化、三聚化,并促进蛋白质之间的特异相互作用。根据结构特征对R基因的分类1)丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域（STK）R基因如番茄Pto基因，其产物是一个没有LRR结构域，位于细胞质内的典型的丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，该激酶在抗病反应信号传导中通过磷酸化其它信号分子而传导信息。目前已经有证据表明Pto蛋白能与相应无毒基因avrPto的产物相互作用。2）LRR-TM(富亮氨酸重复跨膜受体蛋白)LRR-TM类基因是植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因，该类基因相对保守且以基因簇的形式存在，通常编码一类跨膜受体蛋白(Receptorlikeproteins,RLPs)，编码蛋白由6个保守的结构域组成。结构域A是N端信号肽，结构域B由N端成熟蛋白和一个亮氨酸拉链LZ基序组成。结构域C由数量不等的LRR重复单元组成，具有LxxLxxLxxLxLxx(N/C/T)x(x)LxGxIPxx。保守序列中，保守的Gly是胞外LRR的重要标志。该结构域参与蛋白质的相互作用和配体识别，不同基因N端胞外结构域LRR重复单元的数量与不同病原菌生理小种激发子的识别特异性有关，它能够直接或间接识别病原菌的激发子而激活寄主的抗病信号传导及防卫反应此外结构域C通常含有许多潜在的糖基化位点(Asn-X-Ser,N-X-S或Asn-X-Thr,N-X-T)，表明RLPs可能是锚定于细胞膜上的糖蛋白受体。跨膜结构域E是由疏水性氨基酸构成的α螺旋，两侧的结构域则是由带负电的胞外结构域D和带正电的胞内结构域F组成，这两个结构域对蛋白质在细胞膜上的定位和锚定起着重要的作用。结构域F可能参与胞内信号分子的识别与信号传导，部分RLPs的胞内结构域F还含有一个YXXΦ(Φ为带有疏水性侧链的氨基酸)胞吞信号，它能够激发受体介导的胞吞作用和随后对受体复合物的降解作用。3)NBS-LRR类R基因的共同特点：在它们编码蛋白的近N端处存在着核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite，NBS)。而在它们的近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，LRR)。LRR是蛋白与蛋白相互作用的一种典型结构，它是由十多个β折叠-环-α螺旋基本单位串联形成的空间构型，呈蹄铁(horseshoe)状的结构。这些膜受体的LRR结构伸展于细胞外，蹄铁状结构的凹陷处便是结合多样性配体的部位。该类R基因又可分成3个亚类，即LZ—NBS—LRR亚类，如RPS2、PRS5、RPP8、RPP13、RPM1、Rx2、Prf、Mi基因；TIR-NBS-LRR亚类，如RPS4、RPP5、N、L6、L11、M基因：NBS-LRR亚类，如l2、Xa1、Pib、Bs2、Cre3基因。NBS-LRR类,位于胞内。多数R蛋白都可归为这类。许多NBS域具有ATP或GTP结合活性,能水解ATP,并可通过磷酸化和去磷酸化调节蛋白的识别功能,而且它具有一些非常保守的氨基酸序列,被广泛用于R基因家族的分类研究,所以可认为NBS域对应的DNA序列区应同样具有保守性,可用已有R基因的保守序列设计引物进行抗病基因类似物(RGA)的克隆。植物NBS-LRR类蛋白法通过信信号网络途径，并诱发了一系列植物防卫反应，如过氧化酶的激活，丝裂原相关蛋白激酶级联反应，诱导活化病程相关基因，在拟南芥中，至少有三个单独的信号传导途径由NBS-LRR类蛋白激活。4)LRR-TM-STK类R基因，如水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶，它既含有与Cf-9蛋白相似的胞外LRR受体结构域，又含有与Pto蛋白相似的胞内PK结构域，在这两个区域之间存在一个跨膜区。6)Hm1类R基因为玉米抗HC-毒素基因Hml。玉米圆斑病菌(C.carbonum)1号小种产生HC-毒素，它是一个环状的四肽。当玉米在位点Hml隐性纯合时，该四肽是有毒致命的。研究发现显性的Hml编码HC-毒素还原酶(HCTR)，它依赖于NADPH。虽然Hml被认为是第1个被克隆的小种专化性抗病基因，但它不是真正的抗病基因，因为它的抗病作用并没有一系列的信号传导，HC-毒素合成也不止1个基因。该基因的克隆不仅对玉米圆斑病的防治有重大意义，且对植物抗病基因研究，尤其抗毒素研究具有重大意义抗性表达的遗传植物抗病性遗传的研究是从(Biffen，1905，1912)开始的