第六章、碳水化合物的测定

第6章碳水化合物的测定第一节概述一、分类碳水化合物单糖双糖多糖葡萄糖果糖半乳糖蔗糖乳糖麦芽糖淀粉纤维素果胶有效碳水化合物无效碳水化合物二、食品中碳水化合物的分布与含量葡萄糖和果糖主要存在于水果和蔬菜中，含量一般为0.96%-5.82，0.85%-6.53%甘蔗和甜菜中蔗糖含量分别为10%-15%，15%-20%乳糖存在于哺乳动物的乳汁中，牛乳中乳糖含量约4.7%淀粉广泛存在于农作物的籽粒、根和块茎中纤维素主要存在于谷物的麸糠和果蔬的表皮中果胶在植物表皮中含量较高，如柿子皮纸色谱法、薄层色谱法、糖离子色谱法单糖和低聚糖物理法：化学法色谱法酶法相对密度法、折光法、旋光法还原糖法碘量法缩合反应法多糖淀粉：水解为单糖，测定单糖果胶和纤维素：多采用重量法碱性铜盐法铁氰化钾法其他方法碳水化合物三、测定方法种类（一）提取1.常用的提取剂水：温度在45-50℃，一般不超过80℃乙醇溶液：浓度为75～85％一、可溶性糖类的提取和澄清第二节可溶性糖类的测定食品中可溶性糖类通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖及蔗糖等低聚糖。一般须将样品磨碎、浸渍成溶液（提取液），经过滤后再测定。2.提取液制备的原则⑴取样量与稀释倍数的确定,使含糖量(0.5—3.5mg/mL)。⑵含脂肪的食品，须脱脂后再提取。⑶含有大量淀粉、糊精的食品，用乙醇溶液提取。⑷含酒精和二氧化碳的液体样品，应先蒸发至1/3、1/4体积，以除去酒精、CO2。（5）酸性食品应先中和防止低聚糖部分水解.（6）提取固体样品有时需要加热，以提高提取效果。一般在40～50℃，防止多糖溶出（7）乙醇作提取剂加热时应安装回流装置.（二）可溶性糖类的澄清1、干扰物质2、实验室常用的澄清剂干扰物质色素蛋白质可溶性果胶可溶性淀粉有机酸氨基酸单宁乙酸锌和亚铁氰化钾溶液硫酸铜和氢氧化钠溶液中性醋酸铅碱性醋酸铅AL(OH)3乳剂活性碳澄清中性乙酸铅（最常用）可除去蛋白质、单宁、果胶、有机酸等杂质，但脱色力较差；适用于浅色糖液、果蔬制品、焙烤食品等；乙酸锌—亚铁氰化钾（生成氰亚铁酸锌沉淀)吸附或带去干扰物质，对除去蛋白质能力强，脱色力差；硫酸铜—氢氧化钠溶液：碱性条件下，铜离子使蛋白质沉淀，适合于富含蛋白质样品，如乳品等；碱性乙酸铅：澄清能力强，可除去胶质、蛋白质、色素、单宁等大分子物质，但可能会损失部分糖分、适用于深色糖浆、废糖蜜等；氢氧化铝（铝乳）：能凝聚胶体、吸附能力强；活性炭：吸附能力强、适用深色溶液的脱色，对糖的损失较大，不常用。3、常用澄清剂要符合三点要求1）除干扰物质完全，不吸附被测物质糖2）过量澄清剂不影响糖的测量3）沉淀颗粒要小，操作简便4）不改变糖类的比旋光度及理化性质（一）碱性铜盐法直接滴定法KMnO4法萨氏法蓝-爱农法二、还原糖的测定1、直接滴定法（GB5009.7-2010）（1）原理碱性酒石酸甲液＋碱性酒石酸乙液天蓝色氢氧化铜沉淀＋酒石酸钾钠深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物次甲基蓝样液的还原糖＋红色氧化亚铜＋还原态次甲基蓝(无色)次甲基蓝指示剂＋样液的还原糖①碱性酒石酸铜溶液中反应②还原糖被氧化成醛酸CHOHCHOHCOONa+2H2OCOOK+COH(CHOH)4CH2OH2COOH(CHOH)4CH2OH++Cu2OHCHCCOONaCOOKOOCu+2H2O2CHOHCHOHCOONaCu(OH)2+HCHCCOONaCOOKCOOKOOCu+2H2O③终点指示剂：次甲基蓝(蓝色氧化态，无色还原态)COH(CHOH)4CH2OH＋SNN(H3C)2N+(CH3)2Cl-+H2O蓝色COOH(CHOH)4CH2OH+SHNN(H3C)2N+(CH3)2＋HCl无色（2）测定步骤样品溶液测定样品处理碱性酒石酸铜溶液的标定样品溶液预测乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类①样品处理称取约2.50～5.00g固体样品（吸取25.00～50.00mL液体样品）250mL容量瓶50mL水5mL乙酸锌5mL铁氰化钾溶液加水定容混匀，沉淀静置30min过滤滤液含酒精饮料吸取100mL样品蒸发皿1mol/L氢氧化钠溶液中和水浴上蒸发至原体积的1／4250mL容量瓶水定容吸取100ml样品蒸发皿水浴上除去CO2250ml容量瓶水定容汽水等含有CO2的饮料含多量淀粉的食品10～20g样品200mL水45℃水浴中加热1h250mL容量瓶水定容时时振摇混匀，静置，沉淀过滤滤液②碱性酒石酸铜溶液的标定a.碱性酒石酸铜甲液和乙液各5mL，水10mLb.玻璃珠2粒c.加9mL葡萄糖标准溶液d.加热使其在2min内沸腾，沸腾30se.葡萄糖标液以1d/2s的速度滴至蓝色褪去③样品溶液预测a.碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，水10mLb.玻璃珠2粒c.加热使其在2min内沸腾，沸腾30sd.以先快后慢的速度滴加样品溶液，并保持溶液呈沸腾状态，待颜色变浅时，1d/2s的速度滴至蓝色褪去④样品溶液测定a.碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，水10mlb.玻璃珠2粒c.加入比预测时少1ml的样品液d.加热使其在2min内沸腾，沸腾30se.样品液以1d/2s的速度滴至蓝色褪去(3)样品中还原糖的计算1001000250%1Vmm）还原糖（以葡萄糖计式中m——样品质量，g；m1——10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖（以葡萄糖汁）的质量，mg；V——测定时平均消耗样品溶液的体积，mL；250——样品溶液的总体积，mL。①此法测得的是总还原糖量,适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。②在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂③在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾，消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰。(4)说明与讨论④碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合。⑤滴定必须在沸腾条件下进行⑥样品必须预测⑦在滴定过程中对操作条件要求严格:在沸腾溶液中进行,滴定时不能随意摆动锥形2、高锰酸钾滴定样品溶液＋过量的碱性酒石酸铜溶液Cu2O↓Cu2O＋Fe2(SO4)3＋H2SO42CuSO4＋2FeSO4H2O＋10FeSO4＋2KMnO4＋8H2SO45Fe2(SO4)3＋2MnSO4＋K2SO48H2O＋(1)原理样品处理方法同直接滴定法，但所使用的澄清剂为10mL碱性酒石酸铜甲液+4mL40g/L的氢氧化钠溶液.(2)样品处理50mL样品处理液400ml烧杯碱性酒石酸铜甲、乙液各25mL盖上表面皿4分钟内沸腾沸腾2分钟趁热用坩埚抽滤600C热水洗涤烧杯及沉淀至洗液不呈碱性25ml硫酸铁溶液、25ml水用玻璃棒搅拌使氧化亚铜完全溶解高锰酸钾标液滴至微红色空白试验:吸取50ml水代替样液进行(3)测定方法(4)结果计算08.14325)(0CVVm式中m-----样品中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；V-----测定用样品溶液消耗高锰酸钾标准溶液的体积mL；V0-----试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；C-----高锰酸钾标准溶液的浓度，mol/L；143.08----氧化亚铜的摩尔质量，g/mol。100100025021VmmX式中：w--试样中还原糖的含量，%m1---查表得还原糖质量，mgm2---试样质量或体积，g或mLV----测定用试样溶液的体积，mL250----试样处理后的总体积，mL①适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制②此法所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，煮沸后的反应液应呈蓝色(酒石酸钾钠铜络离子)。如不呈蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度。③所用的碱性酒石酸铜溶液与直接法不同。④在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。（5）说明与讨论3、萨氏法Cu2＋+还原糖→Cu2OCu2O+H2SO4＝2Cu++SO42－+H2OKIO3+5KI+3H2SO4＝3K2SO4+3H2O+3I22Cu++I2＝2Cu2＋+2I－I2+2Na2S2O3＝Na2S4O6+2NaI原理结果计算（1）该法是微量法，检出量为0.015-3mg。灵敏度高，重现性好。（2）萨氏试剂中的NaSO4的作用是降低反应液中的溶解氧，避免生成的Cu2O重新被氧化。（3）在加热和冷却时，要防止生成的Cu2O由于空气的对流再次被氧化，用玻璃球盖上试管口可以阻碍Cu2O的氧化。说明与注意事项（4）由于不同的还原糖的还原能力及反应速度不同，反应时所需加热时间也不同（见下表）（5）注意淀粉的加入时间（6）碘化钾不加在萨氏试剂中，使用前在加入本法以Fe3+在碱性条件下与还原糖起反应：2K3Fe(CN)6+R-CHO+2KOH=2K4Fe(CN)6+R-COOH+H2O（亚铁氰化钾）（糖酸）（二）铁氰化钾法2K3Fe(CN)6+2KI+8CH3COOH=2K4Fe(CN)6+I2+8CH3COOK2Na2S2O3+I2=2NaI+Na2S4O6不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量。而是首先按公式计算出氧化还原糖时所用去的铁氰化钾的量，再通过查经验表的方法即可查得试样中还原糖的百分数样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免亚铁氰化钾氧化引入Fe3+。可用中性乙酸铅澄清样品。（三）其他方法（比色法）还原糖（或其反应产物）+显色剂→显色物质比色测定应用得较多有：1、酚-硫酸法葡萄糖或糖类物质糠醛或糖醛衍生物（单糖或多糖）黄至橙色化合物浓硫酸脱水苯酚2、3，5—二硝基水杨酸（DNS）比色法还原糖+DNS有色物(黄色)(棕红色)3、半胱氨酸-咔唑法糠醛或其衍生物+半胱氨酸咔唑试剂→有色络合物（560nm最大吸收）适用于葡萄糖、果糖共存时的果糖测定。NaOH,丙三醇三、蔗糖的测定蔗糖属非还原性糖，但可水解为一个葡萄糖和一个果糖，称为转化糖，可用还原糖法测。对于纯度较高的蔗糖溶液，也可用相对密度法、析光法，旋光法等物理法测定。（一）盐酸水解法（GB/T5009.8)C12H22O11+H2O→2C6H12O6（蔗糖，342）（转化糖，360）故由转化糖的含量换算成蔗糖含量时，应乘以系数：342/360=0.951、原理样品脱脂提取澄清剂蛋白质等杂质样品提取液盐酸水解还原糖溶液还原糖测定还原糖测定脱脂样品处理液水或乙醇提取液2、测定步骤样品预处理样品处理液样品50mL，定容100mL样液50mL还原糖测定5mL6mol/L盐酸68～70℃水浴15min20%NaOH中和定容至100mL还原糖测定3、结果计算（1）直接滴定法式中m1---10ml酒石酸钾钠铜溶液相当于转化糖的质量，mg；V2---测定时消耗未经水解的样品稀释液体积，ml；V1---测定时消耗经过水解的样品稀释液体积，ml；m2---样品质量，g；0.95----转化糖换算为蔗糖的系数。95.0100100025050100100%2121mmVV）（）蔗糖（（2）高锰酸钾法1000100008.14325)(011VVcm1000100008.14325)(022VVcm22CuOCuO%1000.951000100（水）相当的转化糖量（未）相当的转化糖量蔗糖（）50测定用稀样体积样量250说明①在本法条件下，蔗糖完全水解，而其他双糖（乳糖、麦芽糖）和淀粉等水解作用可忽略。②严格控制水解条件，如酸用量，时间，温度等，以防果糖分解及其它糖转化。③只能用HCl水解，否则水解生成的还原糖的还原能力改变④用直接法时应采用标准转化糖溶液（配制：纯蔗糖经水解后中和成中性，计算转化糖浓度）标定碱性铜盐溶液；用KMnO4法时，应查检索表中的转化糖项，以减少误差。2、酶—比色法蔗糖+H2O葡萄糖+果糖葡萄糖酸+H2O2有色物质(比色测定)详见GB/T16286-1996，用专用试剂盒，高选择性。β-D-果糖苷酶β-FS显色剂过氧化氢酶葡萄糖氧化酶(GOD)四、总糖的测定（一）概念食品中的总糖通常是指具有还原性的糖（葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量