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基因编辑鼠的快速鉴定近年来，基因编辑技术广泛应用于细胞、动物等领域，成为研究基因功能的重要手段。基因编辑小鼠主要是利用CRISPR/Cas9技术对小鼠中特定基因进行敲入、敲除、沉默等，以构建基因突变小鼠，建立动物模型。然而，要获得稳定遗传的纯合突变体，需要进行大量的筛选和鉴定。PCR作为最基本、简单且可靠的技术之一，常作为基因编辑小鼠鉴定的方法。在传统的基因编辑鼠鉴定过程中，往往采用柱提取法来制备小鼠基因组用于PCR鉴定，该方法速度慢，离心、挥干等步骤也很容易造成样本间交叉污染导致结果不可靠，且在样本数量较多的情况下，难以实现高通量操作。因此，核酸提取的步骤成为基因编辑鼠鉴定过程中的限速步骤。本文中使用了一种鼠尾直接PCR试剂盒对实验室中保存的一种基因编辑鼠进行了快速PCR鉴定，在2.5小时内完成了样品采集-样品处理-PCR扩增-琼脂糖凝胶鉴定的全部过程。1.材料基因编辑小鼠由本实验室保存；EZ小鼠组织DNA直扩PCR试剂盒购自武汉晟亚生物科技有限公司。2.实验步骤2.1鼠尾的裂解（1）剪取小鼠尾巴1-3毫米，完全浸入MuDNA-EZ-1和MuDNA-EZ-2混合液中。（2）置于50ºC加热30min，95ºC加热10min。（3）加入50μLMuDNA-EZ-3，混合均匀。（4）取2μL上述处理液进行PCR扩增。2.2PCR扩增（1）PCR体系组分20μL体系2×TaqMix(WithDye)10μLForwardPrimer(10μM)1μLReversePrimer(10μM)1μLTemplateDNA2μLDNasefreeddH2O6μL（2）PCR反应步骤温度时间循环数预变性95oC3min30变性95oC15s退火56oC30s延伸72oC30s彻底延伸72oC10min4oCHold3.实验结果用两对引物对小鼠进行了PCR鉴定（W和K），K引物扩增成功说明目标DNA已插入小鼠基因组中；若W和K引物均可扩增出目标DNA，说明小鼠为杂合型；若W引物扩增无目标DNA，而K引物扩增成功，则说明小鼠为基因编辑的纯合子。采用直扩法对基因编辑鼠进行PCR鉴定结果如图1所示，其中3号和6号小鼠为纯合子，而其它小鼠为杂合子。图1直扩法对基因编辑小鼠的PCR扩增4.讨论利用鼠尾直接PCR试剂盒不仅能很好地对基因编辑小鼠进行鉴定，也克服了柱提取试剂盒以及传统法提取的某些局限性。这主要是由于直扩法无需经过离心、挥干等步骤，可以有效减少气溶胶污染。其次，直扩法操作简单，耗时少，效率高。此外，直扩法还可在96孔板、八联管中进行操作，可实现样本的高通量处理，而且直扩法所用试剂安全无毒，不会对操作人员身体造成伤害。参考文献1.HwangWY,FuY,ReyonD,etal.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem[J].NatBiotechnol,2013,31(3):227-229.2.LiJF,NorvilleJE,AachJ,etal.Multiplexandhomologousrecombination-mediatedgenomeeditinginArabidopsisandNicotianabenthamianausingguideRNAandCas9[J].NatBiotechnol,2013,31(8):688-691.3.WangH,YangH,ShivalilaCS,etal.One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeengineering[J].Cell,2013,153(4):910-918.