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第六讲蛋白质分子设计二、蛋白质分子设计的基础在对一个天然蛋白质进行分子设计时，首先要通过各种方法来获得蛋白质的三维结构信息，在此基础上利用生物信息学及计算机模拟技术确定其特定功能相关位点或结构域作为突变位点或要改变的序列区域，然后利用PCR等技术构建突变体并进行突变体的性质表征直到获得所需的蛋白质。（一）蛋白质生物功能的多样性蛋白质作为一类生物大分子，具有重要的生理功能一个基因编码多种蛋白质一种蛋白质产生多种活性多肽一种活性多肽产生多种功能而且，在同一蛋白质分子内部，不同的肽段之间也可能存在着相互调控的现象。Pr分子生物功能的多样性，为我们进行分子设计提供了可能。（二）蛋白质的功能由其高级结构决定蛋白质的功能是与其高级结构相联系的，蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整性马肌细胞磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase）结构域（三）蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系1.蛋白质一级结构的氨基酸顺序，决定多肽链的折叠方式和高级结构；2.一级结构是空间构象的基础，空间构象遭破坏的多肽链只要其肽键不断，其就能恢复到原来的三级结构；3.一级结构相似的蛋白质，大多数其基本构象及功能也相似；但关键活性部位的残基发生变化，会影响其空间构象或生理功能，例：“分子病”（四）蛋白质的空间构象与功能活性的关系别构效应（allostery）:肌红蛋白（Mb）：153个AA残基血红蛋白（Hb）：α亚基和β亚基141个AA中，只有21个位置上的AA相同，但其三维结构十分相似（五）结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子设计结构生物学对蛋白质的静态空间结构研究及其动态结构与功能关系的研究为蛋白质分子合理设计提供理论依据，使蛋白质分子设计的目标性更加明确；蛋白质数据库（theproteindatabank,PDB）：X衍射晶体结构数据、NMR实验数据。三、蛋白质分子设计的原则1．活性设计是蛋白质分子设计的第一步，主要考虑被研究的蛋白质功能，涉及选择化学基团和化学基团的空间取向；另外，可以借助量子力学计算预测所需的催化基团。2．对专一性的设计蛋白质的功能区域可分为催化部位和底物结合部位，其专一性与底物结合部位相关，因此，理解并设计化学基团与底物的专一性结合对蛋白质设计是十分重要的。3．Scaffold设计框架设计，是指对蛋白质分子的立体设计；在分子设计中，框架设计是最难的一步：例：最小的酶分子约10000Da，但只有3个基团参与催化，还有几个基团参与与底物结合，这些基团具有特定功能的关键条件之一就是框架化。溶菌酶结构•例如鸡蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。•其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3’端。4．疏水基团与亲水基团需合理分布不是简单的使暴露在外面的残基具有亲水性，埋藏在里面的残基具有疏水性，而是还应安排少量的亲水残基在表面，少量的亲水残基在内部。5．最优的氨基酸侧链几何排列蛋白质的侧链构象由空间两个立体因素决定：侧链构象决定于旋转每条链的立体势垒；侧链构象由氨基酸在结构中的位置决定。四、蛋白质分子设计的程序•蛋白质分子设计是一门实验性科学，是理论设计过程与实验过程相互结合的产物，在设计过程中，计算机模拟技术和基因工程操作技术是两个必不可少的工具。蛋白质分子设计步骤修正设计获得目标蛋白质序列合成检测结构信息分析建立结构模型设计目标蛋白质数据库•就目前的水平而言，所选择的目标均是一些残基不多（60-80个AA残基）、结构简单并且具有对称性的多肽结构。选择设计目标序列设计•设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；•设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；•而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：•一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；•二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。一、定位突变基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。（一）定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：•热稳定性•对氧化的稳定性•对重金属的稳定性•pH稳定性•提高酶学性质•引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积•把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr•替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu•替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换•专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度（二）定位突变的种类要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。1.定点突变是当前蛋白质工程研究的主体2.盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体突变的加和性原则（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。2．找出对所要求的性质有重要影响的位置•在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。•例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。3．预测突变体的结构根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。4．构建突变体，获得突变体蛋白依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。5．突变体蛋白质的检验•测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，•并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，•同时进一步修正设计方案。要想得到预期的蛋白质，可能需要经过几轮的循环实验才行。蛋白质中功能残基的鉴定突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息确定残基的突变1．根据结构信息确定残基的突变•最有效最直接的方法•AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。2．突变方法鉴定突变功能残基•通过引进另外一种突变来检测•随机突变技术•删除分析及连接片段扫描突变3.利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基•高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关，这些残基常作为突变及功能进化的候选基因；•非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究；•探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。（五）定位突变的应用•目前集中在对具有明显生物功能的天然蛋白质分子加以改性，如胰岛素。•RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例：•T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，建立了RNaseT1S突变体，其热稳定性增加，在55℃保留70%的活性，而野生型的仅有10%的活性。•T4噬菌体溶菌酶包含164个AA，Gassner和Matthews对其研究的结果证明，在该酶结构中不存杂二硫键，只有Cys54和Cys97两个半胱氨酸残基。•Matthews通过分子设计引入3对二硫键，其中5个Cys均是由突变而来，实验证明突变体比天然蛋白质更为稳定。二、蛋白质分子拼接•小的蛋白质分子，有些只有一个结构域，如蝎毒、蛇毒、蜘蛛毒素等多肽类神经毒素；•有的由多个结构域组成：例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它所起的细胞识别和粘合作用。•丙酮酸激酶的分子则有四个完全不同的结构域组成。•蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元件，期望能够转移相应的功能，把优秀的功能结合在一起从而创造出新型蛋白质，最终显著地改变蛋白质的特性。•一般是将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验。我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。第三节全新蛋白质设计全新蛋白质设计过程设计目标序列生成结构预测合成构建模型检测蛋白质从头设计概念从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。从头设计方法可以生成全新的分子结构。全新蛋白质设计包括•一、全新蛋白质设计方法•二、蛋白质结构的从头设计•三、蛋白质功能的从头设计（一）全新蛋白质设计程序模拟分析设计实验一、全新蛋白质设计方法（二）全新蛋白质设计目标的选择•依据设计的目的可以分为：•结构的从头设计–二级结构•功能的从头设计–主要进行天然蛋白质功能的模拟•选定氨基酸顺序•用MonteCarlo法或分子动力学计算其三维模型•目标：使构象的能量水平达到最低和稳定（三）设计方法设计方法的分类•构建新蛋白质的路径主要有两种：•1.完全通过分子中原子的交互作用而设计出一种称之为氨基酸的蛋白质分子链；•2.氨基酸可以随机进行多种化合物的排列组合，这种逻辑的结论就是只要进行足够的组合最终就能够得到想要的新型蛋白质。•首先选择某种主链骨架作为目标结构，随后固定骨架，寻找能够折叠成这种结构的氨基酸组合，即所谓的“逆折叠”方法。•从头设计的蛋白质经常是具有正确的拓扑学结构、明显的二级结构、合理的热力学稳定性，但缺乏天然蛋白质的那种高度堆积特异的构象，呈一种“熔球”状态，或者说是部分折叠，这是目前面临的最大困难和最大挑战。设计中的困难•为达到一种特异的构象，必须有一个高度特异的核心构象，这个核心在所有可能的状态中具有最低能量，并且与其他竞争状态有个较大的能量差异。有两种办法可以达到这个目的。•一种是“反面设计”，即升高竞争构象的能量。例如，使用一个甘氨酸或脯氨酸使该段不易形成a-螺旋而容易形成一个转角，或者在